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第六章 人类疾病动物模型

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第六章 人类疾病动物模型

主要内容
? 第一节 人类疾病动物模型概述 ? 第二节 基本疾病病理过程动物模型 ? 第三节 肿瘤动物模型

? 第四节 各系统疾病动物模型
? 第五节 免疫缺陷动物模型

第一节 人类疾病动物模型概述
人类疾病动物模型(animal model of human diseases)是 指生物医学研究中所建立的具有人类疾病模拟表现的动物 实验对象和相关实验材料。 使用动物模型是现代生物医学研究中的一个极为重要的实 验方法和手段。人类疾病动物模型的研究,实质上是有关实 验动物的应用科学。利用各种动物的生物学特性和疾病特点 与人类疾病进行比较研究,从而加强对人类疾病的发生过程、 机制乃至防治的认识。 长期以来,人们发现选用人作为实验对象来推动医学的发 展是困难的,临床积累的经验不仅在时间和空间上存在着局限 性,许多实验在道义上和方法上还受到种种限制。而动物模型 克服了这些不足点,其在生物医学所起的独特作用,正受到越 来越多的医学科技工作者的重视。

一、动物模型的意义及优越性
1、动物模型的意义 人类疾病的发生发展是十分复杂的,要深入探讨其发 病机制及防治离不开实验研究,而许多研究不可能也不允 许在人体上试验。通过在动物身上复制出类似人类的各种 疾病或某些生命现象,进而有意识地改变在自然条件下不 可能或不容易排除的因素,以便更加准确地观察和分析实 验结果,并将实验结果推论到人类疾病,从而有助于更全 面、更深刻地认识人类疾的发生、发展规律和制订防治措 施。因此,生物医学研究中常常使用动物模型作为临床和 实验假说的试验基础,其意义十分明显。

2、动物模型的优越性 ①避免了在人体上进行实验所造成的危害 临床上对一些疾病的研究不可能在人体上重复进行,而 用动物作为人类的“替难者”,就可以在人为设计的实验条 件下反复观察和研究,甚至为了研究需要可以损伤动物组织、 器官或处死动物。 ②可提供发病率低、潜伏期长和病程长的疾病材料 一般而言,遗传性、免疫性、代谢性、内分泌和*系统 疾病在临床上发病率低,研究人员可以有意识的提高其在动 物种群中的发病率或用不同方法复制出各种模型进行研究。 某些疾病的潜伏期很长,很难进行研究,有些致病因素需 要隔代或者几代才能显示出来,一个科学家很难有幸在人体 进行3代以上的观察,而许多动物由于生命的周期很短,在实 验室观察几十代是很容易的。

③可以严格控制实验条件,增强方法学上的可比性 一般来说,临床上很多疾病是十分复杂的,而采用动物 来复制疾病模型,可选择相同品种、品系、,性别、年龄、 体重、活动性、健康状态等严加控制的各种等级的标准实验 动物,实验时温度、湿度、光照、造影、饲料等实验条件也 可严格控制。用单一的病因作用复制成一定的疾病模型。这 样,对某种疾病及其过程的研究就可排除其他影响因素,使 所得的研究结果更为准确。
④可便于样品收集和简化实验操作 动物模型作为人类疾病的“复制品”,可按需要随时采 集各种样品,甚至及时或分批处死动物收集样本,以了解 疾病的全过程,这在临床上是难以办到的。实验动物的小 型化发展趋势也有利于动物的日常管理和简化实验操作。

⑤有助于全面地认识疾病的本质 已知某些病原体(或病因)既可使人类致病,又 可引起动物发病,在不同物种所导致的疾病表现可 能各有特点。通过对人畜共患疾病进行比较研究, 可以充分认识同一病原体(或病因)对不同机体带来 的损害,对该疾病有更全面系统的了解,从而更有 利于认识该病原体(或病因)在人体上所引起的一切 病理变化。 疾病动物模型的另一用途在于能够细致观察环 境或遗传因素对疾病发生发展的影响,这在临床上 也是难以办到的,对于全面地认识疾病本质有重要 意义。

二、动物模型的分类
(一)按产生原因分类 ⒈实验性或诱发性动物模型 实验性或诱发性动物模型(experimental or artificial induced animal model)是指使用物理、化学、生物等致病因素作用于动 物,造成动物组织、器官或全身一定的损害,出现某些类似人 类疾病的功能、代谢或形态性结构方面的病变,即人为地诱发 动物产生类似人类疾病的动物模型。 优点:制作方法简便,实验条件比较简单,其他因素容易 控制,在短时间内可以复制大量的动物模型。 缺点:主要是诱发的动物模型与自然产生的疾病模型在某 些方面有所不同,如诱发性肿瘤与自发性肿瘤对药物敏感性 有差异;而且有些人类疾病不能用人工方法诱发动物疾病模 型,有它一定的局限性。

⒉自发性动物模型 自发性动物模型(spontaneous animal model)是指实验动 物未经过任何有意识的人工处置,在自然情况下动物自然 发生或由于基因突变的异常表现经遗传育种保留下来的动 物疾病模型。其中主要包括突变系的遗传病和*交系的肿 瘤动物模型。 优点:在一定程度上排除了人为的因素,更接*人类相 应疾病的发病情况,其应用价值很高。 缺点:这类模型目前所发现的种类有限,来源比较困难, 而且自发性疾病模型动物的饲养条件要求高,遗传育种也 比较麻烦,需要一定的时间,若大量使用上存在一定的困 难。

⒊抗疾病型动物模型
抗疾病型动物模型(negative animal modal)是指特定的疾 病不会在某种动物身上发生,因而可以用来探讨为何这种动 物对该疾病有天然的抵抗力。如哺乳类动物均易感染血吸虫, 而居于洞庭湖流域的东方田鼠却不感染血吸虫病,因此,可 用于血吸虫感染机制和抗病的研究。

⒋生物医学动物模型

生物医学动物模型(biomedical animal model)是指利用健 康动物固有的生物学特性来提供人类疾病相似表现的动物模型。 例如:兔甲状旁腺分布比较分散、位置不固定,摘除甲状腺

不影响甲状旁腺功能,是摘除甲状腺实验较理想的动物模型;
沙鼠缺乏完整的基底动脉环,左右大脑供血相对独立,是研究

中风的理想模型;鹿的正常红细胞是镰刀形的,多年来被用于
镰刀形红细胞贫血的研究。但这类动物模型与人类疾病存在着 一定的差异,研究人员在使用这类动物模型时应加以分析比较。

(二)按系统范围分类 ⒈疾病的基本病理过程动物模型 疾病的基本病理过程动物模型(animal model of fundamental pathologic processes of disease)是指具有各种疾病共同的一些 病理变化过程表现动物模型。各种致病原(或病因)在一定条件 下作用于动物后,动物都会出现一些共同的功能、代谢和形态 结构的变化,这些变化不是某种疾病所特有的,而是各种疾病 都可能发生的。如发热、炎症、休克、电解质紊乱等。 ⒉各系统疾病动物模型 各系统疾病动物模型(animal model of different system disease)是指与人类各系统疾病相应的动物模型。如:神经、 心血管、呼吸、消化、泌尿等系统疾病相应的动物模型。

(三)按中医药体系分类

祖国传统医学源远流长,经过数千年的实践,已形成了较完 整的独特体系。如独特的理论体系:辨证论治;独特的评价 标准:证、病、症等;独特的处置措施:中药、针灸、养生; 独特的观察指标:舌、脉、神、色等;独特的认识特色:审 证求因。通过中医药动物实验,建立中医证候动物模型,为 中医基础病理学、基础药理学研究提供了重要的依据。
根据中医证分类,动物模型可分为阴虚、阳虚、气虚、 血虚、脾虚和肾虚动物模型、厥脱症模型等。 按中药理论分类,有解表药、清热药、止血药、补益药、 理气药、*喘药、祛风湿药、*肝熄风药、活血化瘀药、止 咳化痰药等动物模型。中医药动物模型,不论从 “证”或 从“药”分类,每个“证”或“药”的动物模型不止一种动 物,也不止一种方法。

(四)按模型种类分类
疾病模型的种类包括整体动物模型、离体器官和组 织模型、细胞株模型和数学模型。

广义的数学模型是指用抽象符号对原型某些因 素或基本量及其相互关系所作的描述。

狭义的数学模型则仅指描述所研究的系或过程动 态规律的方程而言。

三、动物模型设计原则和评估
(一)设计原则

★相似性原则
★重复性原则 ★可靠性原则 ★适用性和可控性原则 ★易行性和经济性原则

⒈ 相似性原则 在动物身上复制人类疾病模型,目的在于从中找出可以推广 (外推)应用于人体的有关规律。因此,设计动物模型的一个重 要原则就是,所复制的模型应尽可能*似于人类疾病的情况。 为了尽量做到与人类疾病相似,首先要注意动物的选择。

其次,为了尽可能使模型与人类疾病相似,还要在实践中对
方法不断加以改进。例如结扎兔的阑尾血管,固然可以使阑 尾坏死、穿孔并导致腹膜炎,但这与人类急性梗阻性阑尾炎

合并穿孔和腹膜炎不一样。如果给兔结扎阑尾基部而保留原
来的*供应,由此而引起的阑尾穿孔及腹膜炎就与人的情 况相似,因而是一种较理想的方法。

⒉ 重复性原则 理想的动物模型应是规范化的,能够准确地重复再现。为 了增加动物模型复制时的重复性,必须在动物品种、品系、年 龄、性别、体重、健康状况;饲养管理、实验及环境条件、实 验方法步骤;药品生产厂家、批号、纯度规格、给药剂型、剂 量、途径;仪器型号、灵敏度、精确度乃至实验者及其操作技 术熟练程度等方面保持一致,因为一致性是动物模型复制重现 性的可靠保证。

⒊ 可靠性原则

复制的动物模型应力求可靠地反映人类疾病,即可特异性 地反映某种疾病或某种功能、代谢、结构变化,应具备该种疾 病的主要症状和体征,并经化验或X光照片、心电图、病理切 片等检查证实。容易自发地产生某些相应病变或易产生与待复

制疾病相混淆疾病的动物就不宜选用。

4.适用性和可控性原则 复制动物模型时还应考虑到今后的临床应用和便于控制 其疾病发展,以利于进行研究。如:选用大鼠、小鼠作实 验性腹膜炎不适用,因为它们对革兰阴性菌有较高的抵抗 力,不容易造成腹膜炎。有的动物对某一致病因子特别敏 感,实验中无法控制,极易死亡,也不适用。如给犬腹腔 注射粪便滤液能引起腹膜炎,但很快死亡(80%24h内死 亡),来不及进行实验治疗观察。

5.易行性和经济性原则 在复制动物模型时,应遵循经济易行的原则。灵长类动物与 人最接*,复制的疾病模型也很相似,但灵长类稀少价昂,实 验中采用较少;许多小动物如大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠等也可 以复制出十分*似的人类疾病模型,它们的遗传背景大多明确, 体内微生物可加以控制,模型性状显著和稳定,而且价廉易得, 便于管理。因此,科研工作者大多采用小动物复制人类疾病模 型。

(二)动物模型评估
建立疾病动物模型的最终目的是为了防治人类疾病。因此,对 疾病动物模型的评估主要取决于模型与人类疾病的相似或 可比程度。一个理想的疾病动物模型应具有以下特点: ① 能再现所要研究的人类疾病,即动物疾病表现与人类疾病 相似。

② 动物可重复产生该疾病,最好能在两种或两种以上的动物 身上复制该疾病。
③ 动物背景资料完整,等级合格,生命周期能满足实验需要. ④ 动物要价廉、来源充足、便于运送。 ⑤ 尽可能选用小动物。

四、复制方法及其注意事项 (一)复制方法
1、生物因素:如细胞、细菌、病毒、寄生虫、生物毒素、激 素等作为致病原,可通过接种使健康动物发生疾病。 2、物理因素: 不同的物理因素作用于动物可复制出不同的疾 病模型。例如:在机械力作用下产生外伤性脑损伤、骨折等 模型;气压变动复制高空病、潜水病;温度过高或过低产生 烧(烫)伤或冻伤,等等。 3、化学因素:化学因素可直接或间接(通过代谢)引起动物致 病,造成组织、器官或全身损害,出现某些类似人类疾病的 功能、代谢、形态结构方面的变化。如用各种化学致癌物诱 发各种肿瘤,用各种化学毒物或毒气诱发各种中毒性疾病。

(二)注意事项 不同致病因素使动物所产生的临床症状和发病情况是不 同的,研究者应根据研究的需要,有针对性地选择恰当的致 病因素和实验方法。动物的遗传背景、性别、年龄等对模型 复制也有一定的影响,不同品种、性别、年龄的动物存在剂 量、耐受性和副作用等差异。复制动物模型应注意选用标准 化和有实用价值的动物。*交系动物由于存在*交衰退、自 发性疾病多有可能因育种或环境的改变而发生基因突变及遗 传漂变等缺点,需慎重选用。 此外,动物模型复制的成败还与环境因素密切相关。动物 饲料、所处的居住场所、光线、湿度、噪声、等任何一项被 忽视都可能带来严重影响。复制过程中实验操作如固定、麻 醉、手术、药物和并发症等处置不当,同样会产生不良的后 果,因此在复制模型时应充分考虑环境因素和操作技术。

第二节 基本疾病病理过程动物模型

一、电解质、酸碱*衡紊乱及应激反应动物模型
(一)水和电解质代谢紊乱动物模型复制方法 用10%乌拉坦按10ml/kg体重注入家兔或豚鼠耳缘静脉麻醉, 并仰卧固定。分离颈总动脉并插管。将心电图机各针形电极按 导联线标志色分别插入四肢踝部皮下(顺序与人连接相同), 选择Ⅱ或aVF导联描记一段正常心电图。
家兔静脉注入5%氯化钾2ml。出现异常波形后,开动纪录装置,描记一 段心电图,并采血3ml测定血浆钾浓度,然后继续间歇性注入5%氯化钾,每 次2ml,描记异常心电波形。 用豚鼠则从腹腔注入5%KCI 1ml,注意观察示波器荧屏上心电图改变。 每5分钟再腹腔注射5%KCl 0.5ml,直至心电图出现改变时,从颈动脉采血 3ml,测定血浆钾浓度。观察高钾血症的心电图改变。最后注入10%氯化钾, 边注射边观察心电波形改变。出现室颤时,开胸观察心脏停跳情况。

(二)酸碱*衡紊乱动物模型复制方法
手术准备 选取1.5kg以上的家兔,用3%戊巴比妥钠1ml/kg体重静 脉注射麻醉后,仰卧位固定。分离气管,作气管插管。再分 离左侧颈动脉,远心端结扎,*心端用动脉夹夹闭,作动脉 插管。取血用动脉插管内应充满肝素,插好后与动脉连接处 用手术线结扎固定,软胶管用弹簧夹夹闭。手术完成后,采 动脉血测定血气指标,包括动脉血pH、PO2、Pco2、标准碳 酸氢盐(SB)、实际碳酸氢盐(AB)、缓冲碱(BB)、剩余碱(BE) 等。采血方法应严格按血气分析方法操作。采血时要测定体 温。观察呼吸频率及呼吸深浅的变化,并作记录。

复制方法
1.复制急性呼吸性酸中毒 用止血钳夹闭气管插管的2/3,造成气道阻塞,持续10分钟, 按上述方法取血测血气指标并观察呼吸。然后放开止血钳,待 呼吸恢复正常。 2.复制急性代谢性酸中毒 动物呼吸恢复正常后,耳缘静脉缓慢(1ml/分钟)注入5%乳酸 溶液(10ml/kg体重~15ml/kg体重),注射完毕,按上述方法 取血测血气指标井观察记录呼吸变化。

3.复制代谢性碱中毒
动物呼吸恢复正常时,自耳缘静脉注入5%碳酸氢钠10ml~15ml /kg体重,同上法取血测血气指标,并观察记录呼吸变化。

注意事项
在模型复制过程中,应注意动物不要过分饥饿与剧烈运动, 以免体内酸性物质增多,影响实验结果。每次抽血时要注意抽 前放掉插管内肝素,抽血后及时向插管内注入肝素。测血气用 血标本必须保证与空气隔绝,以防结果不准确。 (三)应激反应动物模型复制方法 用一只卵圆钳夹住大鼠头颈部皮肤,另一只卵圆钳夹住 尾部,将大鼠两后腿放入90℃水中(浸至腹股沟处止),烫 10秒。烫后10分钟,眶静脉取血,分离血浆,测皮质醇和 血糖用。皮质醇明显升高。

二、水肿、发热、发热及凝血动物模型复制方法 (一)水肿动物模型复制方法
1.家兔实验性肺水肿 按3%戊巴比妥钠0.8ml/kg体重腹腔内注射麻醉家兔,固定于 兔台上。分离气管和一侧颈外静脉。插入气管插管并结扎固定, 描记呼吸及插静脉管,把静脉导管连接静脉输液装置,注意排 除管道内气体。打开静脉输液装置的螺旋夹,进行输液,缓慢 输入生理盐水(5滴~10d/min)。分别描记正常呼吸曲线,并用 听诊器听肺部的呼吸音,然后输入37℃生理盐水(输入总量按 100ml/kg体重,输液速度为180~200d/min)。待滴注接*完 毕时立即向输液瓶中加入肾上腺素生理盐水(按肾上腺素 0.45mg/kg体重)继续输入。密切观察呼吸改变和气管内是否 有粉红色泡沫液体流出,并用听诊器听诊肺部有无湿性啰音出 现。

死亡动物记录死亡时间,存活动物造病后30分钟则夹住 气管,放血处死动物。打开胸腔,用线在气管分叉处结扎 以防止肺水肿液流出,在结扎处以上切断气管,小心将心 脏及其血管分离(勿损伤肺),把肺取出,用滤纸吸去肺表 面的水分后称取肺重,计算肺系数。然后肉眼观察肺大体 改变,并切开肺,观察切面的改变,注意有无泡沫液体流 出。镜下观察正常肺组织和肺水肿组织切片,计算肺系数。 肺系数计算公式:肺系数:肺重量(g)/体重(kg)。正常兔 肺系数为4~5。

2.大鼠实验性肺水肿 用1%戊巴比妥钠0.4ml/l00g体重腹腔注射大鼠麻醉,固 定于鼠台,观察动物一般表现、呼吸和肤色后腹腔注入 0.1%肾上腺素0.1ml/100g体重。记录时间,观察动物的变 化,注意口鼻有无泡沫样液体流出。动物死亡后,准确称取 大鼠尸体重。解剖尸体,结扎气管后取出心肺,分离心脏 (注意不要损伤肺组织),将肺表面血迹用滤纸撩去后准确称 肺重,然后肉眼观察肺大体的改变,井切开肺,观察切面的 改变,注意有无泡沫液体流出。镜下观察正常肺组织和肺水 肿组织切片,计算大鼠肺系数。肺系数计算公式:肺系数: 肺重量(g)/体重量(kg)。正常大鼠肺系数为4~8。

(二)发热动物模型复制方法
1.大肠杆菌内毒素法 取体重2.0~2.5kg健康家兔,称重,测 量直肠温度,每10分钟一次,测量三次后,静脉麻醉,将 0.20μg/ml精制大肠杆菌内毒素生理盐水溶液经38℃水浴30分 钟后,兔耳缘静脉注入5ml/kg注射后,每隔10分钟测量一次 体温,各测9次~12次。 2.大肠杆菌法 取体重2.0~2.5kg健康大鼠称重,测量直肠温 度,每10分钟一次。自尿中或腹水中分出的大肠杆菌菌株, 用生理盐水调制成0.5ml中含106~107个细菌的浓度,给大鼠静 脉注射,3.5小时~4小时后发热,反应可达高峰,体温升高 1.7℃~2.0℃。浓度增加到108~109个细菌/0.5ml时,动物不发 热而全部死亡,因此以前一种浓度为宜。

3.伤寒杆菌内毒素法 用生理盐水制成内毒素混悬液,按 50μg/kg体重、10μg/kg体重、2.0μg/kg体重和0.4μg/kg 体重的剂量,给大鼠腹腔注射,能出现符合剂量反应的规律。 根据体温升高的情况来看,推荐采用50μg/kg体重腹腔注射 为宜。 4.伤寒~副伤寒菌苗法 可利用现成的伤寒~副伤寒四联菌苗, 按0.5ml/kg~2.0ml/kg给家兔静脉注射,所用菌苗应不低 于100亿/ml。菌苗注入1~2小时,即见直肠温度上升 1.0℃~1.5℃,持续3小时~4小时。 5.啤*湍富煨悍 在实验时用0.5%甲基纤维素或生理 盐水分别制成10%、5%、1%、0.2%啤*湍富煨海 10ml/kg体重的剂量给体重150~200g大鼠背部皮下注射,3 小时后体温上升,6小时可达高峰,体温升高1.2~-2.2℃。凡 直肠温度上升不到0.8℃的大鼠,应予剔除。

6.灭活大肠杆菌或乙型副伤寒杆菌培养液法 将在30℃~37℃培养3周~4周的大肠杆菌肉汤培养液, 或培养了3~4昼夜的乙型副伤寒杆菌肉汤培养液,以细菌 滤器过滤。把留在滤器上的细菌剩余物,放人盛有甘油 lml-2ml的研钵中碾碎、高压灭菌。取该混悬液0.2ml, 以滤过液(肉汤)2ml稀释后,给家兔皮下注射。几小时内 即可引起发热,井持续12小时左右。 7.腐败干草剂法 将约50g的干草浸入1L水中,放在温暖处1~4周,然后 用普通方法将腐败浸液过滤煮沸,使蒸发至原容积一半。 该滤液内含腐败菌及其代谢产物,给家兔静脉注射 2ml~3ml,可在1小时内引起发热,持续8小时~10小时。

(三)炎症动物模型复制方法 1.引起肿胀的炎症模型 选用体重2.0~2.5kg健康家兔,随机分组,用推剪剪去耳壳 背面短毛直至耳根。在一侧耳壳背面下1/3处,皮下注射松 节油0.2ml。于另一侧耳壳相应位置皮下注射生理盐水0.2ml, 作对照。每隔20分钟,观察注射松节油及生理盐水部位的局 部变化,并用卡尺测量肿胀部位厚度,连续6次。观察引起 高峰时间和消退时间,比较两侧差异情况。在注射松节油后 30分钟-40分钟,于注射生理盐水侧的耳缘静脉,缓缓注射 1%锥蓝溶液(3.0ml/kg)。然后观察局部出现蓝染情况,用 直尺测量蓝染范围。注射松节油后1小时~2小时,可见耳廓 下垂,为耳廓功能*9鄄斓6次结束后,剪下双耳,用 直径0.6cm环钻取同一位置两耳片,扭力天*称重,以右耳 重减左耳重为炎症胀度。

2.白细胞渗出的炎症模型
取雄性大鼠,用20%乌拉坦0.5ml/100g体重腹腔注射 麻醉,仰卧固定后,于剑突右侧lcm处剪毛,常规消毒, 将1%角叉菜胶生理盐水0.5ml注入大鼠右胸腔内,引起角 叉菜胶胸膜炎。8小时~12小时后,断头处死动物。打开胸 腔,用注射器抽取渗出液,测定胸膜炎渗出液量。然后, 取一支试管,用吸管准确加入0.38ml白细胞稀释液,加入 20μl炎性渗出液,混匀后将稀释液滴入计数室内静置3分钟, 在低倍显微镜下数四个大方格内的白细胞。计算渗出液中 的白细胞。四个大方格白细胞总数乘以50,即为每ml渗出 液内的白细胞数。最后测定胸腔炎性渗出液中蛋白含量。

(四)弥漫性血管内凝血动物模型复制方法 取幼犬或家兔称重,按3%戊巴比妥钠o.8ml/kg 腹腔内注射麻醉,固定。分离一侧颈总动脉和股静 脉,分别插管,用于取血和给药。采取正常血查Hb、 RBC和纤维蛋白原等。然后按10%高分子右旋糖酐 (40~50万u)15ml/kg在3分钟内从静脉注入,紧接着 再注入纤维蛋白原90mg/kg,给药后的20分钟、40 分钟和60分钟分别按上述检查指标重复检查。

三、缺氧、休克及实验性高血压动物模型复制方法
(一)缺氧动物模型复制方法 1.乏氧性缺氧动物模型复制 取小鼠1只,称重,将其置入含 5g钠石灰的缺氧瓶内。观察一般状态,呼吸频率(次/10s)和幅 度,皮肤及口唇的颜色。盖紧瓶塞,接通水银检压计,记录时 间和实验室温度,以后每隔3分钟重复观察上述指标一次,并记 录水银面上升或下降的刻度,直到动物死亡,记录死亡时间。 将耗氧压换算成耗氧量和耗氧率。再依次打开腹腔,比较* 和肝脏颜色。 2. CO中毒性缺氧动物模型复制 取小鼠一只,观察同上, 尾部取血一滴置装有2ml生理盐水的小试管内备用。再将小鼠 放入缺氧瓶内,连接好CO发生器。自一氧化碳气体产生后, 注意观察小鼠有何变化。等小鼠呼吸明显加深、变慢或出现 痉挛倒下时,立即打开缺氧瓶塞,迅速取出小鼠,然后从尾 部取血一滴,置入2ml生理盐水小试管,与第一次取血颜色对 比。

3.亚硝酸盐中毒性缺氧动物模型复制 取两只体重相*的小鼠,向腹腔内注入2.5%亚硝酸钠 0.3ml,其中一只注药后立即再向腹腔注入0.5%美蓝溶液 0.3ml,进行抢救;另一只注药后向腹腔注入生理盐水0.3ml 作对照。观察同乏氧性缺氧动物模型复制,比较两鼠症状出 现情况及死亡时间。

4.氰化钾中毒性缺氧动物模型复制 取小鼠两只,观察正常表现后,腹腔内注射0.1%KCN 0.2ml。观察同乏氧性缺氧动物模型复制。待动物出现四肢软 瘫时立即取出一只向腹腔内注入10%硫代硫酸钠0.4ml;另一 只注射等量生理盐水作对照。观察两只小鼠症状变化及死亡 时间。

(二)休克动物模型复制方法 1.失血性休克实验

取成年家兔,称重后,耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(1ml/ kg体重)麻醉。颈部手术分离气管、左侧颈总动脉和右侧颈外 静脉,插入气管插管描记呼吸,另一侧连上事先放有肝素的输 液瓶装置,并暂时关闭导管,以备放血用。从右侧颈外静脉插 入5cm长的静脉导管,导管的外端用三通管连上输液管和水检 压计,用来测定中心静脉压和输液,测前,阻断检压计侧管, 使导管与输液瓶相通,缓慢输入生理盐水(5-10滴/分),保持 静脉通畅。 在耻骨联合上方作下腹部正中切口长5cm,找出膀胱,分离 双侧输尿管,插入输尿管导管,用记滴器记录每分钟尿滴数。 在右侧腹直肌旁作长6cm的纵行中腹部切口,打开腹腔后, 推开大网膜,找出一段游离度较大的小肠肠袢,轻轻从腹腔中 拉出,放置在微循环恒温罐流盒内,用显败镜观察肠系膜微循 环。

观察记录
放血前观察动物各项生理指标,包括一般情况、皮肤 粘膜颜色、肛温、血压、呼吸、中心静脉压、尿量、肠系 膜微循环,每组各用肝素化的注射器取2ml血(注童整射器内 勿存气泡,并立即将注射针头刺入胶塞内以密封),备查酸 碱*衡和血气指标。 打开颈总动脉插管与输液瓶装置相连的侧管,放低输 液瓶.使*从颈总动脉流入辖液瓶内,直至血压下降到 5.32kPa时,调节输液瓶高度,控制放出的血量,使直压稳 定在低水*。 维持血压在5.32kPa l5分钟~20分钟,观察失血期间动物 各项生理指标改变,以及肠系膜微循环改变。

2.感染性休克实验 (1)取体重250~300g的大鼠,称重后腹腔注射1%戊巴比妥钠(按 0.4ml/100g)麻醉。将大鼠固定于手术板上。 (2)剪去颈部皮肤被毛,颈部正中切开皮肤,钝性分离、暴露气管, 作气管插管记录呼吸。 (3)分离一侧颈总动脉,用内径为0.5~1.0mm的塑料管向心作颈总动 脉插管记录血压。 (4)作左腹侧切口,并位于阑尾末端上0.8mm~1.Omm处将回肠肠袢 系膜拉出体外,观察肠系膜微循环;也可提起一侧阴囊被膜,用电 烧灼器切开一小口,钝性分离、拉出提睾肌观察提睾肌微循环。 (5)取尾静脉血作血抹片,观察血小板为主的微聚物。 (6)观察动物一般情况、皮肤粘膜颜色及上述各项生理指标后,用生 理盐水将精制大肠杆菌内毒素稀释成40μg/ml,然后在2分钟内按 80μg/kg的剂量从尾静脉注入内毒素造成内毒素休克。注射后60分 钟内密切观察大鼠的一般情况:皮肤颜色、血压、呼吸、心率。肠 系膜或提睾肌微循环及血中血小板微聚物的形成。

(三)实验性高血压动物模型复制方法 复制实验性高血压模型常选用犬、描、家兔和猴等,复制方 法很多,如通过神经反射、外源性儿茶酚胺类或其他体液加压 物质的注射直接刺激中枢神经系统等。缩窄肾动脉致高血压是 十分经典的动物模型。实验中常用的动物为大鼠、兔和犬。 将犬或家兔麻醉后,俯位固定,腹下垫一长枕使腰部顶起, 从脊柱旁1.5~2cm处开始,右侧顺肋骨缘,左侧在离肋骨缘约两 指宽的地方作4cm长的皮肤切口。逐层分离,用手指通过手术区 摸到肾脏,并在肾切迹与主动脉之间找到强力搏动的肾动脉。 按所需长度,小心分离一段肾动脉。选用一定的银夹或银环, (6~8kg犬所用的环直径为0.8~1.2mm,家兔用的环直径为 0.5~0.8mm)套在肾动脉上,或者用缝线将相应直径(约为血管 口径的1/4~1/3)的铁圈绑扎在血管上面。将缝线结扎紧后取下 铁圈。如果是单侧肾动脉缩窄,则应将另一侧肾切除,后一手 术在间隔10~12天进行。一般肾切除手术后几天,血压开始升高, 1~3个月后血压上升达到高峰,并可长期维持下去。

四、器官功能衰竭动物模型复制方法 (一)急性心力衰竭动物模型复制 心肌缺血灌注损伤动物模型复制

取体重200g~250g的雄性大鼠,称重后用1%戊巴比妥钠溶液(0.4ml/100g) 腹腔注射麻醉。将动物仰卧,固定于实验用的木板上,连上心电图机,用Ⅱ 导联记录心电图。剪去手术部位被毛,进行气管插管,待开胸后立即进行正 压人工呼吸(空气通气量:2ml/100g体重,频率48~50次/分)。 在胸骨左侧旁约0.5cm处,从第3至第5肋纵行切开,剪开心包,暴露心脏, 以左冠状静脉主干为标志,于左心耳根部下方2mm处进针,以0号丝线穿过 心肌表层,在肺动脉圆锥旁出针。待心电图恢复稳定10分钟后,予以结扎。 结扎时将硅胶管置于结扎线与血管之间,使硅胶管压迫引起冠脉闭塞,以心 电图出现ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功的指标。5分 钟后松线解除结扎,恢复灌流10分钟。动态记录解除结扎后心电图,即解除 结扎后立即、10秒、20秒、30秒、60秒、2分、4分、6分、8分及10分钟的心 电图。观察心律正常的出现、类型(异位节律、室速、室颤)、发生的时间, 有否死亡。

(二)呼吸衰竭动物模型复制 将家兔称重,麻醉后仰卧固定于兔手术台上。分离气管, 插入气管插管,连接二导生理记录仪张力换能器,描记呼吸。 分离颈总动脉,结扎远心端,*心端插入充满生理盐水的动脉 插管,连接二道生理记录仪上压力换能器,描记血压。用2ml 注射器抽出动脉插管内的死腔液,然后用填充有肝素生理盐水 的l ml注射器取血,迅速套上带橡皮块的针头作血气分析(取血 切忌与空气接触,如针管内有小气泡要立即排除)。
1.复制窒息动物模型 (1)用弹簧夹将气管插管上端侧管所套橡皮管完全夹住, 使动物处于完全窒息状态或在完全夹住的橡皮管上插2个9 号针头,造成动物不全窒息8-10分钟时,取动脉血作血气 分析并观察呼吸变化。 (2)立即放开弹簧夹,等10分钟,待动物恢复正常。

2.复制气胸动物模型 (1)描记正常呼吸、血压曲线,接着于家兔右胸第4—5肋间处切开 皮肤,分离肌肉,暴露胸膜。将经三通管与水检压计相连的塑料 导管插入胸膜腔注入空气,造成右侧气胸,5分钟~10分钟后取动 脉血作血气分析,同时测定胸内压。描记呼吸、血压曲线。 (2)用5Oml注射器连接三通管,将胸腔内空气抽尽,拔出塑料 导管(注意胸腔内的空气一定要抽尽)。 (3)观察10分钟~20分钟,待动物呼吸、待动物呼吸、血压恢复正 常。 3.复制肺水肿动物模型 (1)从耳缘静脉缓慢注入油酸(0.06ml/kg~0.08ml/kg),于注后30 分钟、60分钟取动脉血作血气分析,并观察呼吸、血压变化。 (2)出现明显的血气及呼吸变化后,处死动物,解剖观察肺变化, 并测量肺系数。 (3)切开肺脏,观察有无泡沫样液体流出。

(三)肝功能衰竭动物模型复制 1.CCI4肝脏中毒性损伤动物模型复制 四氯化碳进入动物体内后,可直接进入肝细胞,使线粒体 膜的脂质溶解,从而影响线粒体的结构和功能,使酶蛋白合成 减少,造成酶的破坏及释出的*蚨跋齑患澳芰康纳 成,使肝细胞发生变性、坏死。采用此种动物模型可观察到急 性肝炎时的糖、脂肪、蛋白质色素等方面的代谢*桓卧嘟 毒功能降低;以及迅速出现的营养不良、脂肪变性、肝坏死等 形态学改变。不同剂量的CCI4及不同的给药途径可制成相应 的急性中毒性肝炎或肝坏死。 常用实验动物有小鼠、大鼠、兔、猫。

(1)小鼠、大鼠

①用CCI4 0.5ml/l00g体重作皮下注射,可诱发大鼠脂肪肝、肝 硬变。用40%CCI4橄榄油O.4ml,一次性口服可诱发小鼠肝小 叶中央坏死。
②用CCI4 0.2ml/l00g体重做皮下注射,可诱发大鼠肝细胞水 泡样变性、缺氧、肝小叶中央坏死。 ③用CCI4 矿物油0.033ml/l00g体重做腹腔注射,可诱发大鼠 脂肪肝、肝小叶中央坏死。 ④CCI4 0.5ml~1.0ml/只一次性口服,可诱发大鼠肝小叶中央 坏死。

⑤用CCI4 0.5ml/10g体重一次性口服,可诱发大鼠急性中毒 性肝坏死。

(2)兔
①用CCI4 1.2mml/kg体重一次性口服,可诱发兔肝小叶中央坏 死。

②用CCI4 1.0ml/kg体重一次性口服,可诱发兔急性中毒性肝 坏死。
(3)猫

用CCI4 0.3ml/kg体重一次皮下注射,可诱发猫肝小叶中央坏 死、脂肪肝。
注意事项: 四氯化碳常配成乳化剂使用,如要配成20%乳剂,可取5ml 植物油和5g阿拉伯胶,放在乳钵中研匀,再加纯CCI410ml研 匀,然后加蒸馏水10ml-15ml调成乳状,最后加蒸馏水,使总 量达到100ml,使用时摇匀。

2.手术切除肝功能不全动物模型复制 取家兔1只,体重2kg~3kg,固定于兔台,剪去腹壁正中的 毛,沿上腹切口周围采用1%普鲁卡因局部麻醉。 作上腹正中切口,长约7cm~8cm。打开腹腔,暴露出深红色肝 脏,剪断肝与横膈之间的镰状韧带。再将肝叶向上翻,剥离肝 胃韧带。 用丝线结扎肝左外叶、左中叶、右中叶和方形叶的根部, 阻断血流后切除,仅保留右外叶和尾状叶。 沿胃幽门找出十二指肠,在肠壁上剪一小切口,插入小导 管5cm,作荷包状缝合固定,以备灌入氧化铵溶液。分层缝合 腹膜、肌层、皮肤切口。 每隔5分钟向十二指肠导管中注入复方氯化铵溶液5ml,观 察呼吸、角膜反射、疼痛反射,直至家兔出现痉挛抽搐为止, 计算用去的复方氯化铵溶液总量。注射复方氯化铵溶液时应防 止漏入腹腔。

(四)肾功能衰竭动物模型复制 取杂种犬,体重为22~32kg。将犬在戊巴比妥钠麻醉下进 行手术。暴露一侧输尿管,插入导管收集尿液。游离肾动脉, 注意勿损伤肾脏神经,将血管造影导管插入股动脉,小心用 手把它向肾动脉*荒芊涟鲅鳎纱瞬舛ㄉ鲅鳌 经由一侧肾动脉按照0.75μg/(kg· 分钟)的剂量和速度注入去 甲肾上腺素。注入药物30秒内,肾血流减少到零,且对侧肾 血流也略减少。连续滴注去甲肾上腺素40分钟停药。停药后 收集尿液,与用药前、用药后3小时的尿量比较。同时采血检 查肾功能,测菊糖清除率以了解肾小球滤过率,测对氨马尿 酸清除率以了解肾血流量的变化。一般用药3小时后,肾血流 减少,菊糖清除率显著降低,肾小球的滤过严重抑制,动物 在输注去甲肾上腺*诩洌苎萘棵挥忻飨愿谋洌*均 血压在用药开始的5~15分钟有短暂的升高,此模型较适用于 观察药物对急性肾功能衰竭的疗效。

(五)多器官功能衰竭动物模型复制
1.新鲜鲩鱼胆汁致大鼠多器官功能衰竭动物模型复制 (1)用标准吸管吸取鲜鲩鱼胆汁1ml,按比重法测比重并换 算毫升数。 (2)于实验前48小时灌胃380mg/100g体重的鲩鱼胆汁。 (3)用1%戊巴比妥钠35mg/100g体重进行腹腔麻醉,并固 定于鼠台上。 (4)手术分离大鼠一侧颈动脉,取血1ml做血气、酸碱指标。 (5)切开颈动脉,将切口对准洁净的试管口,抬高鼠尾部, 用试管接血6ml,2000rpm离心15分钟,分离血清以备检测 胆红素、尿素氨、肌酐等。 (6)解剖动物内脏、肉眼观察肝、肾、肺和胃肠等的变化。

2.内毒素致家兔多器官功能衰竭动物模型复制
(1)取健康家兔,体重为2kg~3kg,从兔耳缘静脉注入0.1% 内毒素0.3ml/kg体重。 (2)将兔用3%戊巴比妥钠1ml/kg体重作耳缘静脉注射,麻 醉后固定于兔台,作气管插管、颈动脉插管,接传感器并 连接多导生理记录仪。 (3)注入内毒素后60分钟、240分钟,分别记录心率、血压、 呼吸和心电图,另取颈动脉血1ml(注意肝素化和隔绝空气), 用血气分析仪检测血气和酸碱指标。 (4)继续取动脉血6ml,2000rpm,15分钟离心分离血清, 检测胆红素、BUN等,检测各血清值的变化。 (5)实验结束前用快速放血法处死家兔,游离气管和肺脏, 取出全肺计算肺系数。肺系数=肺湿重(g)/动物体重(kg)。

第三节 肿瘤动物模型
在肿瘤防治研究中,动物模型是主要的研究对象和实 验材料之一。已知的肿瘤动物模型种类很多,可分为三 大类:自发性肿瘤动物模型、诱发性肿瘤动物模型和移 植性肿瘤动物模型。 一、发性肿瘤动物模型 自发性肿瘤动物模型(animal model of spontaneous tumor) 是指实验动物未经任何有意识的人工处置,在自然情况下 发生肿瘤所形成的模型。自发性肿瘤动物模型多来自*交 系动物,如A系和C3H系小鼠自发性乳腺癌、C58和AKR等 品系小鼠自发性白血病、兔的自发性乳头状瘤等。其中以 小鼠的各种自发性肿瘤在肿瘤实验研究中应用较多。

二、诱发性肿瘤动物模型 诱发性肿瘤动物模型(animal model of induced tumor):是 用致癌因素在实验条件下诱发出动物肿瘤所形成的模型。由 于诱发因素和条件可人为控制,诱发率远高于自然发病率, 故在肿瘤实验研究中较自发性肿瘤动物模型更为常用。
用于诱发肿瘤的动物以哺乳动物为主,啮齿类动物如小鼠、 大鼠、豚鼠等应用最广,它们因种系不同对相同致癌因素的 反应性也有差异,在实验时要注意选择使用。常用诱发肿瘤 动物模型的实验方法有:经口给药法(如灌喂等)、涂抹法、 注射法、器官灌注法、穿线法、埋藏法等。可以诱发动物肿 瘤的因素很多,如放射线局部照射、各种化学致癌物(烷化 剂、亚硝胺类、芳香胺类等)、生物毒素(如黄曲霉素)、细菌 (如幽门螺旋杆菌)、RNA和DNA肿瘤病毒感染等,均可起动 物实验性肿瘤。

下面分别介绍诱发性肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、大肠癌、 鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、皮肤癌模型的复制方法。
(1)肝癌 1934年Yeshida首先用邻位氨基偶氮甲苯(O-AAT)诱发大鼠 肝癌获得成功,1937年Shear用O-AAT又诱发了小鼠肝细胞癌。 除O-AAT外,二乙基亚硝胺(DEN)、4-二甲基氨基偶氮苯 (DMAAB、DBA)、黄曲霉毒素 (AFB1)等,均能诱发实验动 物形成肝癌模型。 ①二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌:取体重250g左右的 封闭群大鼠,雌雄不限,按性别分笼饲养。除给普通食物 外,并用0.25%DEN水溶液灌胃,剂量为l0mg/kg,每周1 次,其余每天用0.025%DEN水溶液放人水瓶中,任其自由 饮用,约4个月后可诱发肝癌;单用0.005%DEN搀入饮水中 口服8个月亦能诱发成肝癌。

② 4 - 二 甲 基 氨 基 偶 氮 苯 ( D MA A B ) 诱 发 大 鼠 肝 癌 : 用 含 0.06%DMAAB的饲料喂养大鼠,饲料中维生素B2不应超过 1.5~2mg/kg,4~6个月即可诱发肝癌。

③邻位氨基偶氮甲苯(O-AAT)诱发小鼠肝癌:用含1%OAAT溶液(即0.1ml含1mg)涂在动物的两肩胛间皮肤上,隔日 一次,每次2~3滴,一般涂100次,实验后7—8周即可出现第 一个肝肿瘤,7个月以上可诱发55%的实验小鼠发生肝癌; 或用2.5mgO-AAT溶于葵瓜子油中,给C3H小鼠皮下注射4次, 每次间隔10d,也可诱发成肝癌。
④黄曲霉素B1(AFBl)诱发大鼠肝癌:每日饮料中混入 (0.001~0.015)×10-6的AFBl,连续喂6个月,肝癌诱发率达 80%。

(2)胃癌
建立胃癌模型常用致癌物有甲基硝基亚硝基胍(MNNG)、甲基 苄基亚硝胺(MBNA)和3-甲基胆蒽(MC)等。所用的实验动物, 包括:小鼠、大鼠、地鼠、犬等。 ①MNNG诱发小鼠胃腺癌: KM小鼠,体重18~22g,以500pg/ml MNNG溶液灌喂小 鼠,3次/周,0.4ml/次,12个月后增至0.6ml/次, 约19个月诱发出23.5%(8/34)胃腺癌。或加入200~ 500pg/ml的MNNG于饮水中,自由饮水,实验过程 中不再给予其他饮水,19个月后诱发出16.7%(4/24) 的胃腺癌,并有部分十二指肠腺癌和前胃乳突状瘤。

②MNNG诱发大鼠胃腺癌: 纯系Wistar雄性大鼠,体重100g左右,自由饮水,加入 0.01%的MNND(100μg/ml)隔日一次,试验过程不再给其他 饮水。 ③用MC线结穿挂小鼠腺胃诱发胃腺癌: 取20g左右的小鼠,行无菌手术,在腺胃(胃体)粘膜穿挂 含MC的线结。含MC的线结是用普遍细线,在一端打结后, 将线结置于盛有MC的玻璃试管内,在酒精灯上微微加热,使 MC液化渗入线结。一般MC的量为0.05~0.1g,可制10~20根线, 每条线结合MC约5mg。手术埋线后半个月左右即可形成早期 浸润癌,3~4个月诱癌率最高,且诱发的小鼠胃腺癌组织形态 与人类胃癌相似。

(3)肺癌
在实验动物身上诱发肺癌,要比诱发其他部位的肿瘤困难得 多。因为呼吸道给药时,由于气管或支气管上皮纤毛运动将 致癌物排出,致使诱癌率降低。为此,介绍两种必经过呼吸 道给药的方法。 ①二乙基亚硝胺(DEN)诱发小鼠肺癌:小鼠每周皮下注射含1 %DEN水溶液1次,每次剂量为56mg/kg。结果:DEN总剂 量达868mg、观察时间为100d左右时、发癌率可达40%; DNE总剂量达1176mg、观察时间为半年时、发癌率达94%, 其中支气管鳞癌最为多见,约占41%。

②乌拉坦诱发肺腺癌:A系小鼠(1~1.5月龄)较大鼠敏感,每 次每只腹腔注射乌拉坦生理盐水液0.1~0.3ml,间隔3~5d再注, 共注2~3个月,每只小鼠用量约为100mg,注射后3个月肺腺 癌发生率为100%,且多数为多发性,诱发的肺肿瘤部位和组 织类型也与人类肿瘤相似。

(4)膀胱癌
致癌物N- [4(5 -硝基-2-呋喃)-2-噻唑基]甲酰胺(FANTF)和N丁基-N-[4-羟(基)丁基]亚硝胺(BHBN)可诱发大鼠、小鼠产生 膀胱癌。从组织学观察,大部分肿瘤为移行上皮癌,占90% 以上,与人膀胱癌相类似,被认为是有用的人体膀胱癌动物 模型。 ①FANTF诱发大鼠膀胱癌:选用250g左右的刚断奶的 Fischer(F344)大鼠,用含0.2%FANTF的饲料喂养,服用25— 36周,随机控制饮食,所有大鼠在20月龄之前死于膀胱癌。 ②BHBN诱发大鼠膀胱癌:在饮水中投喂0.05%BHBN给雄性 Wistar大鼠至12周,100%发生膀胱癌;而投喂至8周停止,在 40周末时则有90%发生膀胱癌。用BHBN诱发的膀胱癌织学类 型为移行细胞癌(91.5%)、鳞状细胞癌(3.3%)、未分化癌(2.5%) 及肉瘤(0.3%),这与人类患者所见的情形相似。

(5)结肠癌 大鼠自发性结肠癌很少见,一般发生率为1%或更少。因此, 常用大鼠诱发结肠癌模型。致癌物二甲基苄肼(DMH)和甲基硝 基亚硝基胍(MNNG)均可用来诱发大鼠结肠癌。 其中前者具有致癌性强、器官选择性高和既可口服又可注 射等特点,使用最为普遍。 二甲基苄肼(DMH)诱发大鼠结肠癌:选用4月龄雄性Wistar 大鼠,将DMH先配成100ml中含400mg的溶液,加 EDTA(乙 二胺四乙酸)27mg,用0.1mol/L NaOH调pH至6.5,用此溶 液注射大鼠,每次剂量21mg/kg,每周1次,连续21周。最后次 给药后1~4周处死动物,结肠癌的诱发率为81%~100%,诱发 的结肠癌绝大多数为腺癌。

(6)鼻咽癌

①二甲基胆蒽(MC)插管法:选体重120g左右大鼠,雌雄均可。 取直径2~3mm的硬质塑料管在酒精灯上小火拉成锥形,每段 长约3.5cm,管内填以结晶体MC,小管一端用火封闭,以防 药物外溢,尖端用针刺数孔,使MC能从小孔溢出,将含有 MC的塑料小管插入鼻腔,待半年以后动物自行死亡, 取其鼻 咽部,10%福尔马林固定,脱钙后,石蜡包埋,进行连续切片, 发癌率可达60%。 ②二乙基亚硝胺(DENA)滴鼻法诱导鼻咽癌:取120g左右大鼠 雌雄均可,乙醚麻醉后,用磨*针尖的8号针头,从前鼻孔轻 轻插入,针尖可达鼻咽腔,以注射器灌注1%吐温—80配制 33.3%DENA混悬液0.02m1(含DENA6.7mg)每周一次,共15~ 20次。DENA停药后继续观察,至半年以上或动物自行死亡时, 取其鼻咽部,10%福尔马林固定,脱钙、石蜡包埋,连续切片。

(7)食管癌 甲基苄基亚硝胺(MBNA)诱发食管癌:取1月龄以上 Wistar大鼠,将1% MBNA溶液加在少量的粉末状饲料中,搅 拌均匀,由动物自由摄食,给药量每天0.75~1.5mg/kg。 80~100天可见食管鳞状细胞癌的组织和人类的食管鳞癌相似, 但很少发生转移,给药时间越长,癌的发生率越高,一般可到 80~100%,大剂量给药1次即可致癌。
(8)宫颈癌 取雌性小鼠,在麻醉状况下,借助于阴道扩张器及磨钝的弯 针,将0.1cm的棉纱线结穿入宫颈,使线结固定于宫颈口,线 的另一端则固定于背部肌肉,缝合皮肤,挂线以后,开始连 续注射青霉素2~3天,以防术后感染。在致癌物使用2个月内 观察到轻度不典型变化 (Ⅰ度),在3个月后见中度不典型变 化(Ⅱ度),在5个月后观察到重度不典型变化(Ⅲ度),22%的小 鼠肯定有癌症发生,小鼠宫颈癌的发生步骤与人十分相似。

(9)皮肤癌 实验性皮肤癌的复制影响因素很多如动物的种类、致癌物及 溶媒,致癌物的浓度涂抹频率及时间长短,皮肤所暴露的范围, 致癌物质施于皮肤的方法,都会影响实验结果。常用诱发皮肤 癌的方法是用甲基胆蒽等强烈致癌物,虽然实验间期较长,但 成功率较高。 取24~30g的小鼠,雌雄不限,用硫化钡溶液在背部脱毛,于 脱毛部位涂抹0.5%甲基胆蒽蓖麻油溶液,每周3次,每次2滴, 滴后用小毛刷涂匀。每日观察小鼠一般状况及背部皮肤变化, 如背部毛又长出,仍再用硫化钠脱毛或剪毛,以便涂抹甲基胆 蒽。每天称体重一次,适时取瘤组织作病理检查,并摄影。死 后取肿瘤及各脏器镜检。 涂抹甲基胆蒽后150~200天,所有存活鼠皆出现鳞状上皮癌, 单发或多发,有在乳头状瘤部位癌变,亦有在其他部位突然出 现者。鳞癌出现后,即停止涂抹甲基胆蒽。癌生长迅速,小鼠 通常在l~2周内死亡。死后尸检,未见其他脏器有转移癌。

三、移植性肿瘤动物模型 移植性肿瘤动物模型(animal model of tumor transplant)是 指将动物或人体肿瘤移植同种或异种动物连续传代而培养出的 模型。肿瘤移植于健康动物,相当于活体组织培养,可长期保 存瘤种,供实验所用。目前临床所用的抗肿瘤药物大多数是经 移植性肿瘤动物模型筛选而发现的。 使用此模型筛选药物的优点是:一群动物同时接种同样量的 瘤细胞,生长速率比较一致,个体差异较小,接种成活率* 100%,对宿主的影响相类似,易于客观判断疗效,可连续传 代,试验周期较短,试验条件易于控制等。 常见移植性肿瘤动物模型有:人肝癌、胰腺癌原位移植动物 模型、人胃癌裸鼠原位移植动物模型、人肺癌裸鼠原位移植动 物模型、可移植性小鼠原位膀胱癌动物模型等。

实验中常用大鼠、小鼠为实验对象,以腹水瘤和实体瘤两种 方式建立移植性肿瘤模型。对于会产生腹水的肿瘤,可抽取一定 量的腹水瘤细胞,浓度一般为(2.5-3.0)×107/ml,注入受体动物 腹腔(接种成腹水瘤)或皮下 (接种成实体瘤),每只鼠接种0.2 ml。 实体瘤移植是在无菌条件下,将待移植的肿瘤组织剪成2~3mm2 的小块,用无菌套管针抽吸一小瘤块,接种于受体动物右前肢腋 窝皮下或实验需要的其他部位(接种部位皮肤预先消毒)。
建立移植性肿瘤动物模型最主要的问题是宿主对移植物产生 免疫排斥反应。自体式同系动物肿瘤移植不产生排异现象。同 种动物移植时可结合注射肾上腺素、抗肿瘤药物和适当量的放 射等方法,降低宿主的排斥反应。异种动物移植则难度较大。 1969年Rygaard首次成功地将人类肿瘤移植于裸小鼠(无毛无胸 腺小鼠),这为异种动物肿瘤移植开辟了新局面。自20世纪60 年代以来国内外已建立可移植性人体肿瘤动物模型数百种,为 临床病人的药物筛选作出了巨大贡献。

第四节 各系统疾病动物模型
*一、神经系统疾病动物模型 *二、呼吸系统疾病动物模型 *三、消化系统疾病动物模型

*四、心血管系统疾病动物模型
*五、泌尿、内分泌、营养代谢疾病动物模型

*六、其他疾病动物模型

一、神经系统疾病动物模型
神经系统疾病动物模型包括脑血管疾病动物模型 (分为局灶性脑缺血模型、全脑缺血动物模型、脑 出血动物模型、蛛网膜下腔出血动物模型等)、癫 痫动物模型、帕金森病动物模型、老年痴呆动物模 型等,下面主要介绍脑出血动物模型、癫痫动物模 型和帕金森病动物模型。

1.脑出血动物模型
脑卒中模型的建立多采用两类方法:一种是在动物脑内直接 灌注抗凝或半抗凝的自体血,另一种是利用自发性高血压 (SHR)SP亚型大鼠进行诱发。前者人们可以控制出血量及部位, 一定程度上类似于人脑出血后的病理改变;后者人们可研究有 高血压、动脉硬化等基础疾病发生的脑出血。最*又出现了用 胶原酶诱发脑出血的模型。胶原酶可以分解间质及血管膜上的 胶原蛋白,使血管壁受损,血管通透性增加并向外渗血,进而 *逐渐积聚融合形成血肿。血肿的大小及形成速度由胶原酶 的注入量决定。该法一般选用250~300g的SD大鼠,苯巴比妥 钠腹腔麻醉,在立体定向仪上将Ⅻ胶原酶溶液(1U/m1)注射到 不同部位,注入量为0.25~0.5μl,2h后出现出血片,4h后加重。 该法较自体血输入法成功率高,重复性好,如在胶原酶中加入 浓度为7U/μl肝素1μl,可进一步减少酶用量,增大出血量,症 状出现早且明显。

2.癫痫动物模型 癫痫动物模型分为大鼠部分简单性动物模型(与 外伤性癫痫类似)、大鼠部分复杂性动物模型、家兔癫痫模型和慢 性癫痫模型(氢氧化铝模型、钴模型、硫酸亚铁模型)等。目前认 为研究脑兴奋性、可塑性及长时程增强最实用的癫痫模型为点燃效 应模型。
建模方法如下①大鼠麻醉后固定于立体定位仪上;
②根据大鼠海马CAll区坐标,冠状缝后3.8mm,中线旁2.0mm,双侧颅骨钻孔; ③将尖端裸露的直径0.5mm的漆包线所制的电极置入双侧海马CAll区,并用牙科 水泥妥善固定,也可选择双侧杏仁核团。 ④术后经7d恢复期后,用置人的电极每日给予电刺激。参数为双相方波,波宽 lmm,频率50~60Hz,电流0.2~1.2mA,刺激持续2~6s; ⑤刺激数日记录到对该刺激反应的后放电,随着刺激天数的增加,后放电逐渐延 长并复杂化,直到出现癫痫样放电并伴癫痫发作; ⑥刺激30~50d后,这种癫痫样放电及癫痫发作开始稳定,说明动物已被点燃, 以后不予刺激也有自发性癫痫发作。哺乳类动物均可建立该模型,广泛用于抗癫 痫药物的药效研究,但其发病机制仍未完全阐明。

3.帕金森病动物模型
目前认为:帕金森病(Parkinson disease,PD)与黑质-纹 状体投射系统的多巴胺能神经元退行性变而使神经递质多 巴胺减少有关。 常用的PD动物模型有两种。一种是旋转大鼠模型,即利 用神经毒剂6-羟基多巴胺破坏大鼠黑质的多巴胺能神经元, 并用阿朴吗啡0.25mg/kg诱发大鼠旋转,确定旋转大鼠模 型成功的标准是连续两周测试*均旋转>7次/min,持续 旋转>40min。该模型操作简单、复制成功率高、观察方便, 应用广泛,但不能完整准确地反映PD的临床特征。

另一种是N-甲基-4-苯基-l,2,3,6四氢吡啶(MPTP)所致 的灵长类动物模型(恒河猴等),MPTP本身无神经毒 性,但进入脑组织后在神经胶质细胞及5-羟色胺神经元 内,经单胺氧化酶B催化,转变为MPP+而进人多巴胺 能及去甲肾上腺素能神经元,抑制线粒体ATP的合成, 导致神经元的慢性死亡。 具体方法如下:选用体重6~10kg,8~10岁健康雄性恒 河猴,麻醉后切开颈部,暴露一侧颈总动脉,将MPTP 0.7mg/kg溶于10ml生理盐水中,缓慢注入颈总动脉 (1.0ml/min),压迫止血后缝好伤口。注射MPTP后 3~8d,猴出现强直或震颤症状,表现为注药对侧肢体运 动减少,经常出现向注药侧旋转,仅能用注药同侧上肢 抓取药物。该模型较接*临床,但价格高昂。

二、呼吸系统疾病动物模型
呼吸系统疾病动物模型包括慢性支气管炎动物模型、支气 管哮喘动物模型、肺水肿动物模型、急性呼吸窘迫综合症动 物模型(ARDS)、矽肺动物模型、肺纤维化动物模型、肺 气肿和肺心病动物模型、肺出血疾病动物模型等。这里主要 介绍慢性支气管炎动物模型、支气管哮喘动物模型和肺气肿 动物模型。 ⒈慢性支气管炎动物模型 复制慢性支气管炎动物模型,常选 用大鼠、豚鼠或猴吸如刺激性气体(如S02,氯、氨气等)、烟雾 或细菌感染及多种复合性刺激(如细菌加烟雾)来进行。小鼠吸 入2% S02,每日10s,14~18天即出现支气管炎病变,27天后出 现重型支气管炎病变;大鼠用混合烟(锯末、烟叶、辣椒和硫 磺)吸入,每周6次,44天可形成慢性支气管炎病变。现发现 猪粘膜下腺体与人类相似,且经常发生气管炎及肺炎,故认为 猪是复制人类慢性支气管炎较合适的动物。

⒉支气管哮喘动物模型

激发动物支气管曝喘发作的致敏原有卵白蛋白、血小板激 活因子、蛔虫、天花粉、*菇孢子、内毒素、腺苷和化学物 质如甲苯二异氰酸甲酯,邻苯二甲酸苷和乙二胺等。常选用 豚鼠复制过敏性哮喘。豚鼠是最好的显示气道高反应型特征 的动物,其哮喘发作与人类的表现相似。具体做法是:用生 理盐水配制4%卵白蛋白溶液作致敏原,给每只豚鼠(体重 250g)肌内注射0.1ml,并腹腔注射百日咳疫苗2×1010/只, 致敏后13~14d,将豚鼠置于4L的密闭玻璃罩内,用恒压 (53.2kPa)喷入5%卵白蛋白溶液30s,已致敏的豚鼠在此雾室 内十几秒至数分钟,就出现气喘表现,烦躁不安,呼吸频率 明显加快,呼吸加深。病理检查可发现毛细血管扩张,酸性 粒细胞浸润,腺体分泌活动亢进。

3.肺气肿动物模型
动物气管内或静脉内注入木瓜蛋白酶、菠萝蛋 白酶、败血酶、胰蛋白酶以及由脓性痰和白细胞分 离出来的蛋白溶解酶等,均可引起兔等动物肺气肿。 以木瓜蛋白酶诱发的实验性肺气肿病变明显而且典 型,是常用的建模方法。在用木瓜蛋白酶的基础上, 加用气管狭窄方法可复制肺气肿和肺心病模型,其 优点是病因病变更接*于人。

三、消化系统疾病动物模型
1、消化性溃疡动物模型的制备 消化性溃疡(peptic ulcer)是一种划界清楚的局限性组织 缺失,累及粘膜下层和肌层,其形成与胃酸和胃蛋白酶的消 化作用有关。有关药物抗溃疡实验,现代医学根据溃疡病的 发病学说,创立了各种各样的溃疡动物模型。这些动物模型 不仅对新药的研究做出了贡献,而且为中药抗溃疡病的研究 提供了重要手段。目前抗溃疡中药研究采用的动物模型仍是 西药研究的溃疡模型。用于急慢性溃疡病实验模型的动物主 要有成年大小鼠、兔、狗、豚鼠、猪、羊和猴。大鼠可复制 出十分*似人的较为稳定的溃疡模型。现将消化性溃疡动物 模型复制方法介绍如下。

①手术引起的溃疡(幽门结扎法溃疡动物模型) 取体重180~200g大鼠,手术前大鼠禁食48~72小时,自由饮 水,或实验前洗胃。麻醉后开腹,用线结扎幽门与十二指肠连 接处,注意不要损伤血管。术后18小时处死,也可按需要与不 同时间处死,观察溃疡发生及胃液分泌情况。此法优点是操作 极为简单易行,溃疡发生率高,几乎可达100%,广泛用于抗溃 疡药物的临床筛选。此模型可在一定时间内观察在胃内所积累 的胃液总量以及胃酸浓度,研究胃液分泌机制和溃疡发生。研 究表明,某些解痉药如阿托品、胃复康,抗酸药硅酸盐,H2受 体拮抗药甲氰咪呱、雷尼替丁等对该模型有显著疗效。中药如 益气健脾、活血化瘀、疏肝理气、清热解毒放药对此溃疡也有 良好效果。缺点是结扎幽门是一种非生理状态,将刺激大鼠的 胃液分泌(大鼠能连续分泌具有高浓度酸的胃液)。此法产生 的损伤在大鼠的前胃而不在腺体胃。此法产生损伤的可能机制: 积累的胃液对胃的消化和扩张作用;结扎幽门对局部的神经结 构有直接刺激作用;干扰了胃内的*循环;破坏了胃粘膜屏 障及降低了胃粘膜的抵抗力。

②应激性溃疡模型 该膜型是给动物(大、小鼠、田鼠、豚鼠)施加一定强度的刺 激因素如束缚、束缚水浸、冷冻、烫伤等,可形成急性溃疡。 Ⅰ 冷冻-束缚应激法:取同一性别的大鼠(体重160~240g),禁 食24~36小时,自由饮水。乙醚轻度麻醉,四肢束缚于木板上, 限制动物活动。大鼠清醒后放入冰箱内,维持(5±1)℃,3小时 后取出动物,颈椎脱位法处死,开腹,结扎贲门和幽门,剪断 食管和十二指肠,取出胃,胃腔内注入3%甲醛液10ml,再将胃 置于3%甲醛液中固定l小时以上。然后沿大弯侧剪开胃,用清 水轻洗,去掉胃内污物,评估损伤程度。损伤主要局限于胃, 肉眼可见胃粘膜水肿、充血、点状和条索状出血。该模型制备 方法简便经济,能迅速地引起溃疡,发病率高,可达100%。

Ⅱ 束缚水浸应激法:
取160~180g大鼠,禁食24小时,自由饮水,把大鼠关进特制 的圆形铁丝笼内,垂直浸入水中至剑突部,水温18~20℃,7小 时后处死动物,打开腹腔,结扎贲门与幽门后将胃取出,向胃 内注入1%福尔马林溶液10ml,并将胃浸入同一浓度福尔马林 溶液中10min,固定内外层。沿胃大弯剪开胃,用自来水冲出 胃内容物,将胃*铺于白纸上,观察溃疡发生情况,并测量溃 疡指数和计算溃疡的发生率。此法溃疡位于腺胃部,表现为点 状出血,并可出现点线状或直径1~2mm2圆形表浅性溃疡。
溃疡程度判断:溃疡程度以溃疡指数和溃疡发生率表示。溃疡指数的评定: 无穿孔者以溃疡面积和小溃疡数计算指数。溃疡的最大径大于1mm者计算 溃疡面积(两径相等者为πr2 ,两径不等者为πr1r2),最大径小于1mm者以 小溃疡数计数,以小溃疡总数和溃疡总面积综合评定指数。评定标准:无 病变:0;小溃疡1~5个或面积1~10mm2:1;小溃疡6~30个或面积 11~20mm2:2;小溃疡60个以上或面积21~30 mm2:3;面积31~40 mm2:4; 面积41~50 mm2:5;面积50 mm2以上或穿孔:6。

③药物模型
Ⅰ 利血*溃疡动模型:取体重180~200g大鼠,禁食24小时,自 由饮水。腹腔注射利血*5mg/kg,18小时后处死动物,打开腹 腔,结扎贲门与幽门后取出胃,向胃内注入1%福尔马林溶液 10ml,并将胃浸入同一浓度福尔马林溶液中10min,固定内外 层。沿胃大弯剪开胃,用自来水冲出胃内容物,将胃*铺于白 纸上,观察溃疡发生情况。溃疡指数的评定同应激法。

该模型是酸依赖性溃疡,操作简便,发病率高,但溃疡比较表 浅,适合于中西药抗溃疡药效实验。
Ⅱ 半胱胺 :给予Dawiey小鼠半胱胺盐酸100mg/ml/次口服或 50mg/0.5ml皮下注射,可造成胃酸和胃蛋白酶活性明显增加。 该法几乎所有实验动物均有十二指肠溃疡的形成,最多发生在 十二指肠*端的前壁和后壁,通常糜烂、溃疡和穿透性溃疡三 者并存。这种溃疡形成后可长达100~200天依然不愈合,故特 别适合于慢性十二指肠溃疡的研究。

Ⅲ 非甾体类抗炎药(消炎镇痛药): 这类药物包括阿司匹林(乙酰水杨酸)、吲哚美辛(消炎痛)、 保泰松等,可产生胃粘膜损伤,损伤发生率及严重程度为剂 量依赖性,使用极为广泛,文献资料也极多。此类药物中阿 司匹林最常用,对各种动物及人类的作用都有报道。
阿司匹林 常用雄性大鼠(160~180g),禁食24小时,自由饮水。口 服或腹腔注射剂量为150mg/kg(可增减),4小时后处死,打开 腹腔,结扎贲门与幽门后将胃取出,向胃内注入1%福尔马林 溶液10ml,并将胃浸入同一浓度福尔马林溶液中10min,固定 内外层。沿胃大弯剪开胃,用自来水冲出胃内容物,将胃*铺 于白纸上,观察溃疡发生情况,可见在胃腺体部产生出血性糜 烂性损伤,其损伤发生率及严重程度为剂量依赖性。也可合并 其他刺激物如HCI(100mmol/L)以及注射促分泌剂组胺、胃泌 素等,增加溃疡指数,缩短实验时间。慢性溃疡用1%阿司匹 林液口服数月,主要形成出血和糜烂。腹腔注射用的阿司匹林 溶液配置:3g阿司匹林+3gNaHCO3,溶于100ml蒸馏水中。

吲哚美辛(消炎痛) 吲哚美辛粉溶于5%NaHCO3溶液中,使之成为10mg/ml, 再用蒸馏水稀释成2mg/mI的等张溶液(pH7.5~8.0)。大鼠禁 食24小时后,皮下注射20mg/kg(介于10~30mg/kg),6小时 后处死。溃疡为与长轴*行的点状、线状淤血,很少累及粘膜 肌层。损伤程度随时间延长而加重。 阿司匹林、吲哚美辛均为弱酸性、脂溶性物质,损伤机制 是:能自由扩散进入细胞内,使跨膜电位、膜通透性发生改变, 减少胃粘膜血流量;抑制粘膜细胞内环氧合酶活性,减少前列 腺素合成;抑制粘液及碳酸氢盐分泌,改变粘膜疏水性;H+反 渗入粘膜细胞内。溃疡模型适于对治疗溃疡药物的筛选以及实 验性溃疡的研究。 优点是溃疡发生率高,再现性好; 缺点是溃疡比较表浅。

④高浓度HCI、NaOH、NaCI及乙醇引起的溃疡

雌性大鼠(体重205~215g)禁食24小时,禁水17小时。通过胃 管灌入胃中以下每种致坏死性物质各1ml:0.6mol/L HCI、 0.2mol/L NaOH、25%NaCI、100%乙醇。1小时后处死动物, 取出胃,由大弯切开,展*,观察并计算粘膜坏死损伤的面积 占全腺体的*均百分比。常用于粘膜细胞保护作用的研究以及 筛选有关细胞保护的药物。发生机制为直接损伤胃粘膜而形成 溃疡。

⑤幽门螺旋杆菌诱发的胃损伤 采取感染幽门螺旋杆菌(Hp)的病人标本,分离出其中的I型菌株, 感染普通NALB/c和CD1种系小鼠及无特殊病原菌的CD1系小鼠, 剂量为每次接种109克隆形成单位(co1ony-forming unit,CFU), 每隔两天接种一次,共三次。末次接种一周后,部分动物被感染, 4~8周后全部感染。感染后的动物胃粘膜出现病变,包括胃腺结 构受损,粘膜糜烂和溃疡,固有层大量多形核白细胞浸润等.此 模型用人Hp病原菌感染正常小鼠,感染率高,能诱发出类似于 人类胃炎的病变,并较易大量制备。

⑥缺血-再灌注溃疡模型 Wister雄性大鼠(体重170~220g),禁食24小时,自由饮水。麻 醉后,安装气管插管,保持气道畅通。安装颈动脉三通插管,用 于放血、再输血和血压监测。接股静脉插管,为输液用。开腹, 用生理盐水洗净胃腔。体温维持于36~37℃。血压稳定后结扎贲 门及幽门。将lml HCI 0.1mol/L /100g体重灌入胃内。从颈动 脉放血至注射器,内含0.6ml肝素化生理盐水(100U肝素/ml生理 盐水),使大鼠*均血压降至2.66~3.99kPa(20~30mmHg),维持 20分钟。然后将所放出的*全部自颈动脉逆行输回。再过20分 钟,断头处死大鼠,将胃取下,用2%甲醛液固定,然后沿胃小 弯剪开铺*,用计算机扫描测定胃粘膜损伤面积和胃腺体部总面 积之比的百分数作为损伤指数。缺血-再灌注产生损伤的机制是当 再灌注时产生自由基,引起脂质过氧化而导致细胞损伤。此模型 可造成多种器官的损伤,便于研究损伤的机制,是*年来常用的 一种器官损伤模型。优点是很好地模拟了临床上失血休克-再输血 发生的溃疡,发生率100%,但死亡率高。实验中保持动物体温, 回输*时应缓慢,可减少死亡。

2.病毒性肝炎动物模型
肝炎病毒分为甲、乙、丙、丁、戊等各型,不同 肝炎病毒所引起的肝炎症状不同,动物模型也不一样。 除猴、猩猩等灵长类动物外,大部分实验动物对肝炎 病毒不易感染。我国已报道成年树鼩接种甲、乙、丙 型肝炎病毒后出现与人类相似的肝炎现象,因此树鼩 是较常用的病毒性肝炎动物模型。*年来发现某些鸭 肝炎病毒(如鸭乙肝病毒)的特征与人肝炎病毒十分相 似,故用鸭作为肝炎模型也开始增多。

3.胆石症动物模型

胆结石形成主要是由于胆汁内胆固醇含量超过与 胆汁酸和磷脂的正常比例,导致胆固醇结晶析出所 致。肠道寄生虫或细菌感染可引起动物胆囊炎或胆 管炎,炎性渗出物中的脱落细胞、粘液、细菌等作 为核心,有利于胆固醇、胆色素、胆盐等沉积并逐 渐形成胆结石。因此复制胆石症动物模型的方法主 要有蛔虫卵或大肠杆菌悬液感染法、高糖和不含非 饱和脂肪酸食饵法、狭窄成石法(胆囊结扎、肝总 管结扎)、切除迷走神经法、异物植入法等。常用 的动物有兔、犬、大鼠、地鼠、豚鼠等。

四、心血管系统疾病动物模型
心血管系统疾病动模型包括心肌缺血动物模型 [药物法(垂体后叶素、异丙肾上腺素和麦角新碱) 和电刺激法]、心肌梗死动物模型(结扎法、微珠堵 塞法、汞堵塞法、气囊堵塞法、药物法、血栓形成 法)心力衰竭动物模型(后负荷过重模型、前负荷 过重模型、心肌梗死模型、离体模型、自发性模 型)、心律失常动物模型(过速型、缓慢型、传导 阻滞型)、病毒性心肌炎动物模型、高血压病动物 模型、高血脂和动物粥样硬化动物模型等七类。下 面主要介绍动脉粥样硬化动物模型、心肌梗塞动物 模型和高血压病动物模型。

⒈动脉粥样硬化动物模型 除田鼠和地鼠外,一般温血动物只要用适当的方 法.都能用适当的方法诱发出动脉粥样硬化的斑块状 病变。较常用的动物有兔、鸡、鸽、犬、大鼠、小鼠 和猴等。复制的方法也很多,可分为高胆固醇饲料喂 养和非喂养法两大类。前者是目前比较常用的方法, 特点是死亡率低,可长期观察,但费时久。一般经数 周喂养可使家兔、鸡、鸽、猪等产生明显的高脂血症, 数月后能形成早期的动脉粥样硬化病变。大鼠、小鼠 及犬则较难形成,如果饲料中增加蛋黄、胆酸和猪油 等可有促进作用。为了促使病变形成,在高脂饲料中 还可以加入甲基硫氧嘧啶、丙基硫氧嘧啶、甲亢*、 苯丙胺、维生素D、烟碱或蔗糖等。

复制方法 (1)兔:体重2kg左右,每天喂服胆固醇0.3g,4个月后形成肉 眼可见的主动脉粥样硬化斑块;若每天剂量增至0.5g,3个月 后可出现斑块;若增至1g,可缩为2个月。用兔诱发动脉粥样 硬化模型也有一些缺点,如必须使血清胆固醇达到很高水*, 才能形成斑块,而-这时内脏易发生脂肪沉积,动物寿命短, 抵抗力差,容易继发感染而死亡。再者,兔为草食性动物, 其脂代谢与人体有较大差异。-实验发现其冠状动脉病变主要 在心脏的小动脉。而人主要发生在冠状动脉的大分支。 (2)大鼠:喂养1%~4%胆固醇、10%猪油、0.2%甲基硫氧嘧 啶、86%~89%基础饲料,7~10d可形成高胆固醇血症。用大 鼠建立高血脂及动脉粥样硬化模型,有饲养方便、抵抗力强、 食性与人相*的优点。所形成的病理改变与人早期相似,但 不易形成人体的后期病变,较易形成血栓。

(3)小鼠:雄性小鼠饲以含1%胆固醇及10%猪油的饲料, 7d后血清胆固醇升至(343±15)mg/100ml;若在饲料中再 加入0.3%的胆酸,连饲7d,血清胆固醇可高达 (530±36)mg/l00ml。小鼠模型具有容易饲养和节省药品 等优点,但取血不方便,难做动态观察,故较少采用。 (4)鸡、鸽:4~8周的莱克亨鸡在饲料中加入1%~2%胆固 醇或15%的蛋黄粉,再加5%~10%的猪油,经过6~10周, 血清胆固醇即升至1000~4000mg/l00ml,胸主动斑块发 生率为100%。鸽子每天喂饲胆固醇3g/kg,加甲基硫氧 嘧啶0.1g,可以产生较多的动脉斑块。鸡和鸽均为杂食动 物,食物品种接*人,仅在普通饲料中加入胆固醇就可形 成动脉粥样硬化魔块,、鸽并可发生心肌梗死。

(5)猪:是动脉粥样硬化研究较理想的模型,用高脂饲料喂 养,在相对较短时间内(9~18个月)产生实验型动脉粥样硬 化,并且猪的动脉解剖学和生理学特征与人类相似。 (6)猴:猴与人同属灵长类动物,无论其正常血脂、动脉 粥样硬化病变的性质和部位、临床症状及对各种药物的疗 效关系等,都与人类非常相似、但其不同种属对动脉粥样 硬化的敏感程度有所不同,一般认为猕猴较为理想。猕猴 喂养高脂饮食l~3个月后,血清胆固醇即可达300~600g/ml, 并同时发生动脉粥样硬化,还可产生心肌梗死。其动脉粥 样硬化病变部位,不仅在主动脉,也呈现在冠状动脉、脑 动脉、肾及腹动脉等。

⒉心肌梗塞动物模型 复制心肌梗死动物模型大多选用哺乳动物,其中最常用的 是犬,其他还有兔、小牛、猪、豚鼠、大鼠等。结扎冠状动脉 是制作心肌梗死动物模型最常用的方法。一般用成年健康犬或 家兔,麻醉后开胸,结扎其冠状动脉前降支阻断供血,引起病 变;也有人才用闭胸式选择性冠状动脉插管法,即在荧光屏下 将心导管由麻醉犬的颈动脉切口处插入,沿主动脉壁直抵左窦 底部,将其尖端送至左冠状动脉内2cm深处,向导管内注入 120mg/kg汞,形成急性心肌梗死。 ⒊高血压动物模型 高血压的病因很复杂,因此高血压的动物模型也较多,常用 犬或家兔复制肾动脉狭窄性高血压模型。肾型高血压模型与临 床高血压病的改变相同,对降压药效果也与临床病人相似。犬、 家兔或天鼠在隔音环境下,用电刺激和条件噪声相结合,可造 成动物高度紧张状态,形成神经源性高血压。另外,自发性高 血压大鼠(SHR)的引进,为我国高血压病的研究开辟了又一 条途径。

五、泌尿、内分泌、营养代谢疾病动物模型
泌尿系统疾病动物模型包括肾小球肾炎动物模型、肾小管间 质性肾炎动物模型、局灶性肾炎动物模型、急性肾盂炎动物模 型、急性肾衰动物模型、慢性肾衰动物模型、坏死性肾病动物 模型、泌尿系结石动物模型、前列腺肥大动物模型等九类; 内分泌、营养代谢性疾病动物模型包括甲状腺疾病动物模型、 甲状旁腺疾病动物模型、垂体疾病动物模型(垂体腺瘤)、垂 体功能减退动物模型(尿崩症)、肾上腺皮质疾病动物模型、 糖尿病动物模型、肥胖动物模型等七类。

下面主要介绍肾小球肾炎动物模型、急性肾盂炎动物模型、 泌尿系结石动物模型、甲状旁腺疾病动物模型和糖尿病动物模 型。

⒈肾小球肾炎动物模型 肾小球肾炎是以肾小球损害为主的变态反应性炎症。发病机 理由多种,临庆分型与病理分型相互交错。每一种模型的设计 都是针对某一特定的发病机制,使动物出现类似人类肾小球肾 炎的情况。常用的动物有兔、大鼠、小鼠等。 复制的方法有4种: ①肾毒素性肾小球肾炎,给予异种抗肾血清。 ②血清病型肾炎,又分为急性和慢性两种,给予大量异种血清。 ③抗原抗体复合物型,也称加速型抗肾小球基底膜肾炎,给予 抗基底膜血清加脂多糖。 ④细菌抗原与肾组织抗原致病型,也称L型细菌诱发模型。 (现代医学实验动物学:P473。介绍L型细菌诱发模型、抗基 底膜血清诱发模型和血清病型诱发模型)

⒉急性肾盂肾炎动物模型 该模型一般采用把细菌注人动物泌尿系统的方法复制。常 用动物为大鼠和家兔。 ①大鼠模型:选用200~250g雄性大鼠,大肠杆菌O111B4标准 菌株,大肠杆菌12h肉汤培养,配制3×104~5×104/ml细菌 悬液,大鼠禁水18h,戊巴比妥纳腹腔麻醉,下腹正中切口, 左侧输尿管中端穿线,线端留置腹壁外,从穿线处下端输 尿管向膀胱中注入菌液0.75ml。拉紧缝线,缝合腹壁,20h 后拆除拉线。3~9天可见肾肿大,包膜紧张,肾盂脓肿,脓 性尿,光镜下有明显炎症反应。 ②家兔模型:兔左侧卧位,左肋弓,脊柱角*分线切开皮 肤肌肉,暴露出输尿管,进行结扎,术毕从兔耳一次性注 入致尿路感染性大肠杆菌每公斤0.2×109/ml,24h,解除梗 阻,4周后造模完成。大体可见肾缩小,苍白,肾髓质瘢痕, 肾盂内脓性分泌物,中度纤维化,肾小管萎缩。

⒊泌尿系结石动物模型 泌尿系统结石由尿内多种晶体物质和非晶体物质凝聚而成, 可发生于肾、输尿管、膀胱、尿道等处。结石的病因尚未明确, 可能与尿内晶体浓度增高及尿夜理化因素的改变有关。常用药 物诱发秘尿结石动物模型,选用的动物有大鼠、新西兰兔等, 具体方法如下: (1)乙二酰胺饲喂法:选用SD大鼠,体重220~240g.新西兰 家兔,4月龄,体重2.0~2.3kg。饲喂1.2%乙二酰胺—鼠标准饲 料3d以上,100%的大鼠造成泌尿系结石如输尿管、膀胱结石等。 新西兰兔饲喂1%乙二酰胺—兔标准饲料20d,100%复制成肾结 石。 (2)TPA和DMT饲喂法:选用F-344*交亲大鼠,研磨对苯 二酸(TPA)拌入食物制成含3%~5%的饲料或二甲基对苯二酸 (DMT)拌入食物制成I%~3%的饲料,分别喂养14~28d。饲喂 14d后即可诱发出泌尿系结石模型,其症状和对药物的反应性与 人类的自发性结石很相似,膀胱病变也是由于结石引起而不是 诱发药物的作用。

⒋甲状腺疾病动物模型 甲状腺疾病常见的动物模型主要以外源投予甲状腺激素和 抗甲状腺药物来建立。选用的动物有大鼠、Beagle犬等。 常见模型及复制方法有:①缺碘及功能减退模型:用地方性 甲状腺肿病区的粮食,按当地居民饮食*惯配制饲料喂饲动物, 造成碘缺乏及甲状腺肿大。②实验性甲状腺肿模型:应用抗甲 状腺药物(如丙基硫氧嘧啶、甲基硫氧嘧啶、他巴唑等)抑制 甲状腺滤泡细胞摄取碘及碘被利用,抑制甲状腺素合成,造成 实验性甲状腺肿大。③克汀病模型:手术切除大部分或全部甲 状腺(用胎羊复制先天性克汀病);用131I破坏甲状腺滤泡细 胞。④甲状腺炎模型:选用遗传性、自身免疫性甲状腺炎动物 (Beagle犬易自发淋巴细胞甲状腺炎)。⑤实验性甲抗模型: 口服或注射三碘甲腺氨酸(T3)或甲状腺素(T4),造成甲状腺 功能亢进,由于碘摄取不足、代谢*仍虻贾录鬃聪俅 性增生肥大。

5.糖尿病动物模型 常用于建立糖尿病模型的动物有大鼠、兔、犬等。常用的复制方 法有:

① 注射高血糖因子,如生长素、胰高糖素、糖皮质激素及儿茶 酚胺类激素等;
② 手术切除胰腺的全部或大部分,并给予高糖饮食,引起继发 性永久性糖尿病; ③ 注射化学物质,如链脲佐菌素、四氧嘧啶,破坏胰岛β细胞, 造成胰性糖尿病; ④ 注射根皮苷使肾小管对糖的再吸收发生*⑵苹吊ッ福 致 使葡萄糖磷酸化过程和脱磷酸过程*,引起根皮苷糖尿病; ⑤ 病毒诱发,如鼠脑炎、心肌炎病毒M型变异可诱发DBA/2、 C57BL等若干品系的成年小鼠糖尿病; ? 筛选、引种、繁殖自发性及遗传性糖尿病动物等。

化学诱导是一种简便、价廉的方法。引起糖尿病的化学 物质很多,分为两大类:一类是引起β细胞不可逆损伤,如链 脲佐菌素、四氧嘧啶;早一类则因起β细胞可逆性损伤,如环 丙庚哌啶、6-氨基尼克酰胺-2-脱氧葡萄糖、甘露庚酮糖等。以 往常用四氧嘧啶复制糖尿病动物模型,但复制的模型在生理上 不同于人类所患的糖尿病。*年多采用链脲佐菌素诱发动物糖 尿病模型。链脲佐菌素在酸化生理盐水中溶解成1%溶液,给 大鼠、犬等腹腔或静脉注射(30~100)mg/kg一次,几天后可观 察到血糖持续升高,当血糖>400mg/dl,持续3天即认为造模 成功。链脲佐菌素致糖尿病作用稳定、快速、方便,无自然缓 解,几乎不受饲料成分和营养状况的影响,对四氧嘧啶有抗性 的豚鼠,用链脲佐菌素也可致糖尿病,因而一般认为其优于四 氧嘧啶。但链脲佐菌素也有不足之处,一是价格较四氧嘧啶贵, 二是其在造成糖尿病的同时,也可造成白内障、冠状动脉粥样 硬化斑块等。

六、其他疾病动物模型
免疫性疾病动物模型(如变态反应性肝损伤动物模型、血 小板减少动物模型、自身免疫动物模型、系统性红斑狼疮动物 模型、免疫性脑脊髓炎动物模型等)、骨伤疾病动物模型(如 骨折愈合动物模型、骨关节炎动物模型、骨质疏松动物模型、 风湿性关节炎动物模型、股骨头无菌性坏死动物模型等)、理 化损伤疾病动物模型(放射损伤疾病动物模型、烧伤动物模型、 烫伤动物模型、冷冻伤动物模型、冲击伤动物模型、撞击伤动 物模型等)、口腔科疾病动物模型(如牙周病动物模型、口腔 溃疡动物模型、龋病动物模型等)、五官科疾病动物模型(如 角膜炎动物模型、白内障动物模型、青光眼动物模型、视网膜 疾病动物模型、中耳炎动物模型、神经性耳聋动物模型、鼻炎 动物模型等)、传染病及寄生虫病动物模型等。

第五节 免疫缺陷动物模型
免疫缺陷动物模型(immunodeficient animal model)是指由 于动物体内免疫系统缺陷而致动物发生疾病的模型。在长期的 进化过程中,某些动物由于控制免疫细胞功能的基因发生突变 而成为免疫缺陷动物,经人们发现和培育后用于生物医学的研 究。免疫缺陷动物品系的培育已从啮齿类动物扩展至牛、马等 大型哺乳动物,从单一的T淋巴细胞免疫缺陷(如裸小鼠、裸大 鼠)发展到联合免疫缺陷(如T和B细肥均缺陷的SCID小鼠)。免 疫缺陷动物模型已成为免疫学、肿瘤学、,遗传学、细胞生物 学研究的重要工具,受到人们的极大重视。

一、分类
人们根据动物体内免疫系统缺陷的程度和性质不同,将其分 为五大类:

⒈T淋巴细胞功能缺陷的动物模型 如:裸小鼠、裸大鼠、裸 牛、裸豚鼠等。
⒉B淋巴细胞功能缺陷的动物模型 如,:CBA/N小鼠、雄 性种马和1/4杂种马、Arabin马和Quarter马、免疫球蛋白异 常血症动物等。 ⒊其他免疫细胞功能缺陷动物模型 如:Beige小鼠、无齿大 鼠、显性半肢畸形小鼠、P/J小鼠等。 ⒋联合免疫缺陷动物模型 如:SCID小鼠、Motheaten小鼠、 其他人工培育的先天免陷动物等。

⒌获得性免疫缺陷病动物模型 如猴获得性免疫缺陷综合症模 型、家兔恶性纤维瘤综合症模型。

二、各类免疫缺陷动物模型的特点
(一)T淋巴细胞功能缺陷的动物模型 ⒈裸小鼠 1962年英国格拉斯哥医院的Grist在非*交系小鼠中偶然 发现有个别无毛小鼠,后来证实是由于基因突变造成的,并 伴有先天性胸腺发育不良,称为裸小鼠(nude mice),用“nu” 表示裸基因符号。1966年Flanagan证实这种无毛小鼠是由于 第11号染色体等位基因突变引起的。1968年Pantelouris发现 裸小鼠失去了正常胸腺结构,淋巴结胸腺依赖区的淋巴细胞 消失,外周血中淋巴细胞数目减少。1969年丹麦Rygaard首 先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成功。这些发现引起了医学 和生物学工作者极大的兴趣,为免疫缺陷动物的研究和应用 开辟了新局面。

裸鼠的饲料和繁殖要求条件比较严格,1969年里加德 (Rygaard)和Ffiis报告采用SPF条件下饲料繁殖裸鼠虽然获得 成功,但也发生传染性疾病。*十年来,许多国家建立了自己 的有封闭屏障系统的饲料设施以及相应的质量控制办法,进一 步促进了裸鼠研究工作的迅速发展。1978年根据英国LAC News的报告,除用“nu”基因导入*交小鼠的方法成功地培 育成千余种遗传背景明确的裸鼠外,还培育了无胸腺肥胖裸鼠, 无胸腺无脾脏裸鼠以及裸体大鼠等,预计不久的将来,根据不 同的实验需要,将会培育出更多的无胸腺杂交品系。目前,已 成立了国际性专门组织——国际裸鼠管理及应用委员会,并分 别在1973年、1976年1979年召开了三次裸鼠会议。我国实验动 物工作者过去在小鼠的大量繁殖中也曾发现过无毛小鼠,但未 进行研究。最*三、四年来,由于科研工作的需要从国外引起 了裸鼠。1978~1980年间,中国医学科学院所属单位曾先后从 法国、英国、美国获得裸鼠。我国卫生部药品生物制品检定所 在1980年从日本引进裸鼠鼠种进行了繁殖,饲料在屏障室内, 经过16个月的饲料,繁殖正常,并已提供给科研工作使用。

裸小鼠的主要特征是无毛(hairless)、裸体(nude)和无胸腺 (athymus),并随年龄增加皮肤变薄,头颈部皮肤皱褶,发育 迟缓。由于裸小鼠无胸腺,仅有胸腺残迹或异常上皮,且这 种上皮不能使T细胞正常分化,因而缺乏成熟T细胞的免疫功 能。裸小鼠B淋巴细胞正常,但功能有欠缺,免疫球蛋白主要 是IgM,只有少量IgG。成年裸小鼠(6一8周龄)较普通小鼠有 较高水*的NK细胞活性。但幼鼠(3~4周龄)的NK细胞活性低 下。裸小鼠粒细胞也比普通小鼠数量少。 裸小鼠抵抗力差,易患病毒性肝炎和肺炎,因此饲养和繁 殖条件要求比较严格。一般所用的笼具、垫料、饲料、饮水 等都得经过灭菌消毒并采用隔离器、或在SPF环境下饲养,以 保证长期存活和繁殖。由于纯合型雌裸小鼠(nu/nu)受孕率低, 乳腺发育不良且有食仔*惯,所以在生产上一般用纯合型雄 鼠与杂合型雌鼠交配(♂nu/nu~♀nu/+)可获1/2纯合型子 代。

纯系裸体小鼠外形和原种相同,全身几乎无毛,偶而背部可 见稀疏的的带状毛、皮薄、光滑或有皱折。皮肤色素BALB/C 裸体小鼠为浅红色,白眼;C3H裸鼠为灰白色,黑眼;C57BL 裸鼠黑灰色至黑色,运动功能正常。 裸鼠淋巴细胞特殊,因此种动物无胸腺,致T细胞生成* 虽然T细胞和B细胞的前身正常,但因缺乏胸腺,故不能生成正 常T细胞。
由于裸鼠原种抵抗力差,生育力低,寿命短,不能用于实 际。因此人们又致力于育种改造,分别和纯系BALB/C, C3H,C57BL/6小鼠交配,不断选育,获得了三种*交系无 胸腺裸体动物(Inbred Nuede Mice)新种,虽然某些生物学 性状有所改善,但尚未克服上述缺点,故又将*交系 BALB/C裸鼠和NIH瑞士种小鼠交配获得远交系无胸腺裸体小 鼠(Outbred Nude Mice),从而克服了上述缺点,能够大量 繁殖与推广。

裸鼠在生物医学研究中的应用

*年来,无胸腺裸鼠作为一种新的动物模型,活跃于免疫 学、肿瘤学、毒理学等各个领域的研究工作中,尤其在免疫生 物学、免疫病理学、移植免疫、肿瘤免疫、病毒和细菌免疫将 等领域,在短短的数年中,就展开了一系列富有成效的新的研 究,推动了各方面的工作,为实验免疫学、实验肿瘤学多供了 新的有效的工具。 ①组织移植(人类肿瘤移植)研究
由于裸鼠的免疫缺陷,在一定情况下,不排斥来自异种动物 的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。目前已成 功地结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白 血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获 得了一定百分比的良好生长,并可传代。若用已建株的人体肿 瘤组织培养细胞作移植材料,接种后的成活率更高。我国北京 医科大学等5家医院,使用北京药品检定所繁殖的裸鼠对人体结 肠癌、直肠癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、咽癌、骨巨噬细胞 癌的移植均获得了成功。

肿瘤已成为当前威胁人类最严重的常见病之一,每年死于 此病的人数以百万计,因此,建立模型,进行防治研究,是 基础医学研究中的重要课题。
从研究范围来看,有以下六个方面。 1.人癌细胞株致癌性的检测及其裸鼠移植瘤的建立。 2.人癌裸鼠移植瘤的建立及其生物特性的研究。 3.人癌浸润转移调控机理的研究。 4.乙型肝炎病毒基因工程疫苗研究中高效表达HBsAg细胞系 致癌性检定。 5.人癌实验性治疗的研究。 6.肿瘤病因学的研究一化学致癌物质致癌性的研究。 成就:北医的人肠粘膜腺瘤裸鼠移植瘤,裸鼠间的移植传代成 活率为100%,具有人类原发瘤特性。并获得了肺癌高转移率 的裸鼠移植瘤。又如乳腺髓样瘤等细胞系致癌性检定和裸鼠移 植癌的建立,其成功率为83.8~100%,超过了国际上60%的 报导。

移植于裸鼠的人类恶性肿瘤具有以下特征:
1.被移植肿瘤仍保持原有组织学构造或各种机能。 2.将人癌组织的组织培养物移种于裸鼠时,能重现已在组织培养中消 失的原有的癌结构。 3.几乎未发现被移植肿瘤的转移。 4.裸鼠体内免疫缺陷机制恒定,其它鼠类需另加去免疫措施,其条件 恒定性受个体差异因素影响。 5.可以控制肿瘤的致癌性,使人体肿瘤移植后良好生长。 6.接种成功的瘤结构具有原肿瘤的结构特点,有利于体外培养的瘤细 胞株的鉴定; 7.研究肿瘤在体内的生长行为与过程,探讨肿瘤与宿主免疫间的相互 关系。 8.体内和体外研究互补配合进行观察。 9.可利用其建立稳定的动物模型,进行药物筛选。肿瘤细胞形态、染 色体含量和同功酶水*与人体肿瘤一样,说明未发生细胞选择和细胞杂 交现象,细胞动力学和生物化学特征也未改变。 10.在动物体内进行连续接种传代后的肿瘤细胞,在体外培养中也易于 获得长期生存,可提高培养的成功率等。

②肿瘤药物治疗和肿瘤免疫研究
裸鼠接种成活的肿瘤对化疗药物的敏感性与临床所见十分相*。黑色素瘤以 DTIC和CCNU的抑瘤作用较强,而5-Fu则无效,与其临床客观疗效(三药 分别为20%、12%及2.5%)结果相似。最*,对过去因毒性较大而中断研 究的偶氮氧代正亮氨酸,重新用人肿瘤裸鼠模型评价,证明对MX-1和肺癌 LX-1有明显疗效,又重新进入临床研究。*有人用胸腺嘧啶核苷等444~ 888mg/kg给肿瘤裸鼠连续灌注96~140小时,发现它能明显抑制人体黑色素 瘤及畸胎瘤的生长,并导致肿瘤消退而对宿主无明显毒性,这些新结果已引 起了临床重视。 *年来将人癌组织移植入裸鼠肾囊膜内,观察肿瘤生长大小,在双目显微镜 下测量肿瘤直径OMU,比较给药组和对照组的差异,在11天左右可以得到 评价药物疗效的结果。 在肿瘤免疫研究方面,France报导无胸腺裸鼠用4(5)-33-二甲基-1三唑-5 (4)碳胺[Dic4(5)-33-dimethyl-1-triazlon inidazole-5(4)Carboxamide]处理后, 明显增强了对L1210和L3TRA淋巴瘤株的免疫原性。

③免疫和遗传研究
由于*代遗传学的迅速发展,已发现40余种免疫缺陷病与 遗传因素有关。许多报导只介绍了这些疾病的临床表现和实验 室检查结果,有关发病机理则停留在假说阶段,这主要是由于 没有与人类所患的免疫缺陷性疾病相对应的自发性实验动物模 型,无法通过患病动物来观察疾病发生与发展的全过程,从而 无法阐明其遗传规律。 先天性无胸腺裸鼠的遗传因素,免疫动物原缺陷指标以及剖 检所见和组织学观察等特征,均与人类免疫缺陷性疾病中的原 发性细胞免疫病相似。各品系裸鼠因遗传背景的不同,所表现 的细胞免疫反应和实验室检查指标亦各不相同。这些裸鼠种群 是研究人类各种免疫缺陷性疾病的发病机理和遗传规律的动物 模型。实验动物遗传学家已育成具有不同免疫缺陷特性的*交 系小鼠达50余种。我国所应用的自发性免疫缺陷小鼠,主要应 用的是BALB/C遗传背景的裸鼠,个别实验室也应用了NIH、 ICR等非*交系裸鼠。

④病毒、细菌、寄生虫感染机制的研究 无胸腺裸鼠的T淋巴细胞缺损,免疫机能低下,是研究病毒、细 菌及寄生虫感染机制的极好模型动物。如可用于研究乙型脑炎 SA14-14-ZHK7减毒株为乙脑活毒疫苗的选育株,在正常小鼠 体内可产生符合规定的免疫原性(LD50),而在胸腺缺少或胸腺 发育不良的生物个体免疫原性如何,对于今后现使用具有参考价 值。实验结果可见表4-3,以BALB/C(+/+)小鼠为对照。 以上结果说明,乙脑病毒感染后所产生的免疫力,主要属于细胞 免疫,如使T细胞缺陷的裸鼠体内产生与免疫功能正常小鼠同等 水*的免疫力,必须加大40倍的免疫剂量,才能达到。也说明裸 鼠体内还存在着残余的T淋巴细胞。由此推论,在现场人群中产 生抗体水*较低者,其T细胞功能是否缺陷,应作为因素之一加 以探讨。 裸鼠已被证明是研究T淋巴细胞功能缺损下,分枝杆菌感染的 最好模型,其肿瘤的自发率极低。

⑤生物制品和药品的检定 生物制品(疫苗、菌苗)的安全性的免疫原性是制品必 不可少的内容之一。它涉及制品是否有潜在制癌性、感染因 子以及它的毒力是否有返祖的可能性。特别是在应用动物组 织培养疫苗或人类二倍体细胞株时,对检出这些细胞潜在的 致癌性、某些制品引起的异常发应及其发生机理、对药物致 癌性或抗癌药物的研究等诸方面,先天性胸腺机能缺陷的裸 鼠是很好的动物模型和实验手段。 ⑥ 微生物学上的研究 以往人类麻风杆菌只有背上够九条纹的犰狳(qiu yu,Armadillo)身上才能生长,而这种产于南美等地的动物难 于寻找,也不易饲料和操作。1975年Colston等将麻风杆菌接 种于裸鼠足掌,发现麻风杆菌可大量繁殖,全身扩散,引起 瘤型麻风。这为研究麻风杆菌的生物特性、免疫原性和麻风 病发病机理提供了极为有用的实验模型。

⑦内分泌和老年医学上的应用 在人工摘除胸腺动物,大多数研究可见脑下垂体、甲状腺、 肾上腺、性腺等出现异常。有人用无特定病原体环境中的饲料 的裸鼠和正常小鼠进行研究,分析3、9、11周龄的雌雄动物的 脑下垂体生长激素及甲状腺、肾上腺皮质和性腺的功能,结果 发现两者间未见有统计学上的差别。 在老年医学的研究上,有人认为裸鼠没有T细胞,容易引起 自身免疫现象,皮肤的可溶性胶原(Collaggen)也减少,因此 认为胸腺、自身免疫、老化三者之间是有关系的。但这方面也 有不同论点。
裸小鼠国内常用品系为BALB/C-nu/nu,Swiss-nu/nu 和Nc-nu/nu等。利用育种技术将裸基因(nu)导入*交系小 鼠,已培育出20余种*交系裸鼠,不同*交系裸鼠具有不同 的生物学特征,在研究中要注意选用。

2.裸大鼠
裸大鼠是英国阿伯丁Rowett研究所首先在1953年发现的,基因 符号为r n u,。因难于饲养,仅维持至1960年代初。1975年再 次发现纯合子裸大鼠(rnu/rnu)。1977年2月在英国MRC实验 动物中心建立了裸大鼠种子群。1978年Festing首次详细描述了 裸大鼠,并报导了裸大鼠人癌异种移植。此后rnu裸大鼠分别引 入欧洲及美日等国。1983年引入中国。1976年5月在新西兰维多 利亚大学发现了另一株裸大鼠,1979年由Mcneilage进行了详细 报导。为了与rnu裸大鼠区别,其基因符号命名为nznu。因rnu 裸大鼠的应用范围较广,故绝大多数资料来自rnu裸大鼠。

利用先天无胸腺裸小鼠建立动物人癌模型,是肿瘤模型研究 的重大进展。这些模型已广泛用于各种研究。裸大鼠的发现及 人癌异种移植的成功,给肿瘤和免疫工作者增添了一个新的手 段。由于以裸大鼠代替裸小鼠,具有移植瘤大、取血量多、可 行某些外科小手术等优点,因此比裸小鼠有具一定的优越性。

裸大鼠的特点
①免疫器官及血细胞特性 裸大鼠免疫器官的组织学,与裸小鼠极为*似。Vos等报告, 在3周龄裸大鼠纵膈的连续切片中,只见胸腺残体,内有未分 化的上皮细胞及小囊种,而未见淋巴细胞。纯合子裸大鼠 (rnu/rnu)肠系膜及腘淋巴结相对小于杂合子(rnu/+)。淋 巴结副皮质区实际上淋巴细胞。脾的外形及重量上,杂合子与 纯合子并无区别,但依赖胸腺部位的小动脉周围淋巴细胞。 Berridge等报导,裸大鼠的白细胞总数在正常鼠范围之内,但 分类计数却有明显不同。纯合子(nznu/nznu)的中性白细胞 较杂合子(nznu/+)高4倍,而杂合子的淋巴细胞较纯合子高 2.5倍。Vos报告,rnu裸大鼠*淋巴细胞计数随年龄而降低, 而嗜中性、嗜酸性及单核细胞计数则明显地增高。

② 免疫功能特性 Ⅰ T细胞功能:先天性无胸腺,缺少T细胞,T细胞功能明显有丧 失。对皮肤移植,在杂合子对照组,同种皮肤移植约在10天后排斥, 但在rnu裸大鼠,同种或异种皮肤移植生长可达3~4个月以上。对 迟发型超敏反应,rnu裸大鼠对结核菌素无阳性迟发型超敏反应。 用破伤风类毒素和卵蛋白免疫,rnu裸大鼠血中未能测出IgM及IgG 抗体;而在杂合子大鼠血中,可测出正常滴度的破伤风毒素抗体。 对T细胞有丝分裂原(植物血凝素、刀豆球蛋白和美洲商陆)的淋 巴细胞转化试验呈阴性反应。 Ⅱ B细胞功能:一般说B细胞功能是正常的。Brooks等用抗Ig及抗 T细胞抗体对rnu/rnu及rnu/+大鼠脾和淋巴结细胞行免疫荧光染色 检查,发现在rnu裸大鼠,Ig+标记的细胞及裸细胞比例增加,而大 多数Ig+标记细胞被认为是B淋巴细胞。测定rnu裸大鼠与表现型正 常大鼠(rnu/+或+/+)对大肠村菌LPS的IgM抗体滴度,没有发现 明显差别。在体外用B细胞有丝分裂原金黄色葡萄球菌刺激rnu/rnu 及rnu/+大鼠脾细胞,也未见摄取胸腺嘧啶能力的差别。

Ⅲ NK细胞功能:NK细胞活力增强。De Jong报告,裸大鼠 NK细胞活力高于对照组。在肠系膜淋巴结,rnu裸大鼠NK活 力比杂合子(rnu/+)高达10倍之多。Lotzovd将这方面的工作 归纳如下:裸大鼠可测及NK细胞的活力;在腹腔渗液中, NK细胞的活力最高,周围血及脾脏内较低,骨髓无NK细胞 活力;裸大鼠NK细胞活力高于胸腺大鼠;小于3周龄者未能 测及NK细胞活力;用干扰素诱导剂ABPP可以提高NK细胞活 力;介导细胞毒性的效应细胞存留于富含LGL部分中;NK细 胞活力的加强与干扰素的水*有关。
③其它特征 Ⅰ体毛稀少:裸大鼠并非象裸小鼠那样完全无毛,而是体毛 稀少,有时暂时完全消失,以后又复现。年龄较大的雄裸大 鼠的尾根往往多毛。

Ⅱ发育相对迟缓:与裸小鼠一样,rnu裸大鼠发育相对缓慢。 其体重仅相当于正常大鼠的70%。

Ⅲ 雌性大鼠繁育能力低:与裸小鼠一样,雌裸大鼠在妊娠期 无乳腺发育,仔鼠因得不到母乳,生后很快死亡。故裸大鼠繁 殖,仍用雄纯合鼠(rnu/rnu)与雌杂合鼠(rnu/+)交配繁方 法。新生仔鼠中纯合体与杂合体的鉴别,主要以触须的多少为 据。仔鼠4周左右断奶,生后3个月可用地交配。雄裸大鼠可用 至7月龄,雌半裸大鼠(rnu/+)可用至一年多。在洁净环境下, 寿命最长的裸大鼠可活1~1.5年。 Ⅳ 易患呼吸道疾病:裸鼠因无胸腺,免疫力低下,易患各种 疾病。裸小鼠易患鼠肝炎,而裸大鼠易患溃疡性气管支气管炎 及化脓性支气管肺炎。其病因可能与仙台病毒感染有关。饮水 中加入四环素,对控制裸大鼠呼吸道感染有明显效果,使寿命 延长,如加四环素200~800mg/L,则*均寿命由116.8天延长 到157.2天。

裸大鼠的应用 裸大鼠目前主要应用于人癌的移植研究。因裸大鼠无胸腺, 缺少T细胞,故能成功地移植异种皮肤和异种肿瘤,包括小鼠 肿瘤及人肿瘤。Festing首先报告了裸大鼠异种肿瘤移植(人结 肠癌及小鼠浆细胞瘤),但移植瘤生长后自发消退。此后陆续 见到有关人癌细胞株及手术标本移植于裸大鼠的报导。裸大鼠 人癌移植最常用皮下途径,也有用肾内、脑内肌肉内者。可以 生长于裸大鼠的移植人瘤有黑色素瘤、恶性胶质瘤、以及结肠、 胰腺、肺、乳腺、肾、前列腺、外阴、宫颈等癌瘤。大多数人 癌移植后,可见自行消退,仅少数肿瘤呈进行性生长。 Colston报告9例人癌细胞株,7例移植成功,仅一例黑色素 瘤呈进行性生长而未自发消退。Stragand报告两例人结肠癌细 胞株移植成功,但只有Lovo细胞株呈进行性生长;而另一株 SW620移植成功后,90%裸大鼠可见肿瘤自发消退。Williams 移植了5例人泌尿生殖系肿瘤细胞株于裸大鼠,3株成功,仅1 株肾癌未见自发消退。

3.其他T细胞缺陷动物
有无毛牛(Beummer Stedt,1978)和无毛豚鼠 (O'Donghue &Reed,1981)等。无毛豚鼠与裸小鼠 和裸大鼠有明显的相似性,可用来代替裸小鼠和裸 大鼠,由于其体型较大,更适合肿瘤移植和生长研 究或外科手术等,同时是皮肤病和巨细胞病毒(CMV) 研究的有用模型。垂体功能减退的侏儒(Dwaff)小鼠, 其隐性突变dw位于第16号染色体,也有原发性的胸 腺发育不良和T细胞功能缺陷,是研究内分泌和免疫 系统关系的良好模型。

(二)B淋巴细胞功能缺陷动物模型 ⒈CBA/N小鼠 起源于CBA/H品系,特点是B淋巴细胞功能 减退,而T细胞功能正常,为X-连锁的隐性突变品系,其基因 符号为xid。纯合型雌鼠(xid/xid)与杂合型雄鼠(xid/y)对Ⅱ型 抗原(非胸腺依赖性抗原)如葡聚糖、肺炎球菌脂多糖以及双链 DNA等没有反应,对胸腺依赖性抗原无抗体产生,血清中IgM、 IgG低下。如果移植正常鼠的骨髓至xid宿主,B细胞缺损可得 到恢复。相反,将xid鼠的骨髓移植至受放射线照射的同系正常 宿主,仍为不正常的表型,是研究B淋巴细胞的发生、功能及 异质性最理想的动物模型,其病理特征与人类Bruton丙球蛋白 缺乏症和Wiskott-Aidsch综合征相似。 ⒉雄性种马和1/4杂种马 1983年Perryman发现X-连锁的γ 球蛋白缺乏可见于雄性种马和1/4杂种马,特征是B淋巴细胞缺 乏,T淋巴细胞正常。γ球蛋白血缺乏症种马是自法产生的酷似 X—连锁女婴无γ球蛋白血症(人类X—性连锁遗传的6种免疫缺 陷病之一)的惟一动物模型,迄今为止,所有病例均发生于雄性 马。

(三)其他免疫细胞功能缺陷的动物模型
⒈Beige小鼠 为隐性基因突变系,基因bg位于第13号染色体上,首先 由Oak Ridge实验室从放射处理的小鼠中发现。这种小鼠的 特征是bg基因纯合小鼠的毛色变浅,耳朵和尾巴色素减少, 尤其是出生时眼睛色淡,其表型与人类Chedian-Higashi综合 征(CHS)相似。免疫学特点是内源性NK细胞活力缺乏,中性 粒细胞对细菌的杀伤作用降低,巨噬细胞抗肿瘤作用出现较 晚,缺乏细胞毒T细胞反应,对同种、异种肿瘤细胞的体液 反应受损。亚细胞结构中可见异常肿大的溶酶体颗粒和溶酶 体膜缺陷。由于溶酶体功能缺陷,bg小鼠对化脓菌感染非常 敏感,对各种病原因子也都较敏感,所以需在SPF环境中才 能较好地生存,繁殖一般用纯合子进行。

⒉显性半肢畸形小鼠
显性半肢畸形(dominant hemimelia mice)小鼠其基因符号为 Dh,是显性突变基因,位于1号染色体上,现有品系为B6C3Dh。纯合子(Dh/Dh)小鼠由于泌尿生殖系统和和骨骼系统的 严重畸形,出生后很快死亡。杂合子(Dh/+)小鼠其表现为半 肢畸形(主要为前肢异常)和缺乏脾脏,另外,泌尿生殖系统、 消化道也有一定程度的畸形。由于缺脾,体液免疫反应受到一 定损害。这种小鼠无需特殊的饲养条件。如果将无脾(Dh/+) 雌鼠和裸(nu/nu)雄鼠交配,可培育出无胸腺、无脾的Lasat 小鼠。Lasat小鼠需要在SPF环境中饲养,可生存9~12个月, 获得与裸鼠相同的年龄,接触致癌物后,肿瘤发生率未见增加; 而移植人体肿瘤后,可明显提高移植瘤的生长率,且保持原有 肿瘤的病理学特征。因此,Lasat小鼠与裸小鼠相比能提供更 好的探讨肿瘤治疗的实验模型。Lasat小鼠也是研究脾、胸腺 及骨髓功能相互关系的良好模型。

3.无齿(ti)大鼠 Gaine于1980年发现无齿大鼠。这是一种新的骨石化病动 物,为隐形常染色体自发突变所致。其特征是:破骨细胞 缺乏或减少,酸性磷酸酶明显缺乏,是人类骨石化病理想 的动物模型。

⒋其他细胞免疫缺陷动物 如HRS/J-hr小鼠高发淋巴瘤,无毛并伴有T细胞异常;巨 噬细胞功能缺陷常见于C3H/HeJ小鼠、A/J小鼠、P/J小 鼠;肥大细胞缺陷见于WBB、W/W小鼠等。

(四)联合免疫缺陷的动物模型 1.SCID(severe combined immune deficiency)小鼠 SCID意为严重联合免疫缺陷,为一隐性突变基因,位于16 号染色体上。1980年美国Bosma首先发现于C.B-17*交系小鼠, 1988年由美国Jackson实验室引入我国。SCID基因纯合子小鼠 (seid/scid)T细胞和B细胞大大减少,细胞和体液免疫功能缺 陷,但巨噬细胞和NK细胞功能未受影响。 由于SCID小鼠在细胞与体液免疫方面的缺陷,现已广泛用 于免疫细胞分化和功能的研究,以及异种免疫功能重建、人 自身免疫性病、免疫缺陷病、病毒学与免疫学等方面的研究, 成为一种较理想的免疫缺陷动物模型。如用SCID小鼠接种人 体肿瘤,其成功率远高于裸鼠。 SCID小鼠外观与普通小鼠无异,体重发育正常,但极易死 于感染,因而必须饲养在SPF环境,正常情况下寿命可达1年 以上。两性均具有生育能力,繁殖一般用纯合子进行,每窝 产仔约3~5个。

2.Motheaten小鼠 1965年在Jackson实验室的C57BL/6J小鼠生产群 中发现,为一常染色体隐性突变系,其基因称为me, 位于第6号染色体上。这种小鼠在出生2d后可出现 皮肤脓肿,有严重的免疫缺陷,对胸腺依赖和不依 赖抗原均无反应,对T和B细胞分裂素的增殖反应 严重受损,细胞毒T细胞(CTL)和NK细胞活性减低。 纯合型(me/me)小鼠还伴有自身免疫倾向,免疫 复合物可沉积在肾、肺、皮肤。该小鼠对判别生命 早期免疫功能缺陷和某些自身免疫性疾病的发生都 是十分有用的动物模型。

人工培育的先天性联合免疫缺陷型小鼠 如CBA/N-nu 系小鼠是将裸小鼠基因(nu)导入CBA/N小鼠,该系小鼠T 细胞、B细胞功能均缺陷。国外已将分布于3种小鼠的3个隐 性突变基因,即致NK细胞缺陷的bg基因、T细胞缺陷的nu 基因和B细胞缺陷的xid基因,经过杂交、筛选及导入,育 成了T、B、NK细胞三联免疫缺陷的Beige-nude-xid小鼠。 我国孙靖等利用自行培育的单一T细胞功能缺陷的PBI/1裸 小鼠(615/PBI裸鼠),采用杂交—回交和回交—互交系统育 种技术,育成了PBI/3-xid· beige裸小鼠(CB· 615/PBIxid· beige裸鼠。免疫学特性研究表明,PBI/3-xid· beige裸 小鼠为T、B、NK细胞功能均低下的一种新型免疫缺陷动物。 此外,我国陈桦等将Beige小鼠致NK细胞缺陷基因导人 SCID小鼠体内,也得到了T、B、NK细胞功能三联免疫缺 陷小鼠(B· B-17SCID-beige小鼠)。 C·

(五)获得性免疫缺陷病模型 1.获得得性免疫缺陷综合征(simian acquired immune deficiency syndrome,SAIDS)模型 1969年美国加利福尼亚、华盛顿和英国新英格兰等地灵长类 研究中心在猴群中相继发SAIDS,其临床症状为全身性淋巴 腺病、贫血、反复腹泻、消瘦和体液及细胞免疫功能降低、 淋巴细胞减少、循环性T4(辅助/诱导性)淋巴细胞和T8(抑 制/细胞毒)淋巴细胞的比例显著下降等免疫学特征,与人 类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)十分相似,可用来研究人类 AIDS的预防、治疗和发病机制。现已明确SAIDS是由逆转 录病毒即人T淋巴细胞白血病毒Ⅲ(HTLV-Ⅲ)进入猴体内后 感染T淋巴细胞,使猴免疫功能抑制而引起。
⒉兔恶性纤维瘤综合征模型 兔恶性纤维瘤病毒(MV),是一种与肖普纤维 瘤病毒(SFV)和Voses兔粘液瘤病毒(MYV)有关的痘病毒。恶性纤维瘤 综合征兔的免疫学特征表现为:严重的免疫功能抑制,淋巴细胞对有丝 分裂原的增殖反应低下,其临床症状如免疫功能缺陷、条件致病微生物 感染和播散性肿瘤等,与人类AIDS病有不少相似之处,是人AIDS病研 究的有用的动物模型。




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